세포 구조 및 기능의 교란을 위해 게놈 편집 된 세포주 세포주 간의 세포 융합
Summary
이 프로토콜의 목적은 하이브리드 셀을 만들기 위해 두 개의 서로 다른 세포 유형을 융합하는 것입니다. 융합 된 세포의 형광 현미경 분석은 세포 소기관의 기원의 세포를 추적하는 데 사용됩니다. 이 분석은 세포 구조와 기능이 세포 융합에 의한 교란에 어떻게 반응하는지 탐구하는 데 사용될 수 있습니다.
Abstract
생활은 세포와 세포기관 내부의 뚜렷한 분자 상태의 분리된 형성을 허용하기 위하여 지질 막 내의 공간적으로 분할됩니다. 세포 융합은 단일 세포를 형성하기 위해 2개 이상의 세포를 합병하는 것이다. 여기에서 우리는 2개의 다른 세포 모형의 세포 융합을 위한 프로토콜을 제공합니다. 융합된 하이브리드 세포는 유세포분석 기반 선별에 의해 농축되고, 하이브리드 세포 구조 및 기능의 형광 현미경 검사법에 이어 풍부하다. 게놈 편집에 의해 생성된 형광 태그가 붙은 단백질은 융합된 세포 안쪽에 심상하게, 세포 구조물이 형광 방출에 근거를 둔 확인되고 기원의 세포 모형에 다시 참조되는 것을 허용합니다. 이 강력하고 일반적인 방법은 기본적인 생물학 질문의 범위에 걸쳐 세포 구조 및 기능을 이해하기 위하여 관심있는 다른 세포 모형 또는 세포기관에 적용될 수 있습니다.
Introduction
세포 구조의 적시성 유지는 삶에 매우 중요합니다. 세포에는 특징적인 형태, 세포 소기관 수 및 내부 생화학 적 조성이 있습니다. 이러한 근본적인 특성이 어떻게 생성되는지, 그리고 질병 중에 어떻게 엉망이 되는지 이해하려면 실험실 도구가 필요합니다.
세포 융합은 2개 이상의 분리된 세포의 병합이다. 세포 융합은 진핵 생명의 출현에 중요했을 수 있습니다1. 인체에서 세포 융합은 비교적 드물며, 수정 또는 근육, 뼈 및 태반의 형성과 같은 제한된 발달 상황 및 조직 유형 동안 발생한다2. 이 프로토콜은 세포 구조 및 기능을 제어하는 메커니즘을 이해하는 도구로 서, 분별적으로 표지 된 세포기관과 조직 배양 세포 주에서 세포 융합의 유도를 설명합니다.
시험관내 유도 세포-세포 융합은 생물학적 연구 및 질병 치료를 위한 중요한 도구인 단일클론 항체3의생산의 중심이다. 세포 융합은 또한 세포 주기 우호에 관하여 많은 다른 근본적인 세포 생물학 질문을 하기 위하여 이용되었습니다4,aneuploidy5,6,세포 재프로그래밍7,8,손상된 신경의 수선9,바이러스성 증식10,세포증11,종양발생12,세포골격역학13,및 막 융합14,15. 세포-세포 융합을 유도하는 실험실 기반 방법16,17,18,19는 두 개의 이중층의 물리적 병합을 통해 지질막 유착을 유도한다. 세포 융합은 전기18,바이러스 기반 방법17,열플라스모닉 가열20,트랜스젠 발현19,폴리에틸렌 글리콜(PEG)16,21,22에의해 유도될 수 있다.
중원체는 세포 모양, 운동성, 편광 및 분열23을제어하는 미세소관 조직 센터입니다. 중심도 뿌리는 단백질뿌리줄기(24)를 함유하는 중심으로부터 연장되는 섬유질 구조이다(유전자 CROCC에의해 인코딩). 우리는 최근에 세포 세포 융합을 사용하여 부모 세포24에비해 중도위치및 수가 이종내의 다른 지 를 이해했습니다. 이 방법의 사용 뒤에 근거는 차별적으로 형광 태그 부모 세포의 융합 후 이종 내 뿌리의 기원의 세포를 추적하고, 따라서 이미지 세포 간 융합 및 핵분열이다. 형광 태그단백질 뿌리레틴-meGFP 또는 rootletin-mScarlet-I는 PEG 매개 세포 융합에 의해 융합되는 별도의 세포주에서 게놈 편집에 의해 생성됩니다. 우리는 유세포분석및 유래세포의 후속 형광 현미경 식별에 의한 융합세포를 식별하기 위해 세포염료(자료표)의사용을 설명한다(그림1). 이 접근은 세포 기관 번호를 포함하여 세포 상태에 있는 중요한 변경이 세포 항상성에 어떻게 영향을 미치는지 연구하는 강력하고 유일한 방법입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 세포를 융합하고 현미경 검사법으로 세포 하이브리드의 후속 아키텍처를 시각화하기 위한 효과적이고 비용 효율적인 프로토콜을 시연하며, 처음부터 끝까지 약 2일이 소요됩니다. 이 프로토콜의 중요한 부분은 세포 선별 (프로토콜 섹션 3)에 의한 융합 세포의 농축 및 현미경 검사법에 의한 융합 세포의 신중한 검증 (프로토콜 섹션 4)입니다. 이 단면도는 융합한 세포가 쉽게 장악되고 선의…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 R.M.에 웰컴 트러스트 헨리 웰컴 펠로우십에 의해 투자되었다 (https://wellcome.ac.uk/grant 번호 100090 / 12 / Z). 자금 은 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 아무런 역할이 없었다. 아쇼크 벤키타라만과 폴 프렌치가 프로젝트에 대한 중요한 조언과 안내를 해주신 것에 감사드립니다. 우리는 우수한 지원을위한 케임브리지 연구 흐름 세포 측정 시설에 대한 케임브리지 연구소의 키아라 코세티와 가브리엘라 Grondys-Kotarba 감사합니다. 리암 카시데이, 토마스 밀러, 지안마르코 콘티노에게 원고를 증명해 주신 것에 대해 감사드립니다.
Materials
| 15 ml tube | Sarstedt | 62554502 | |
| 37% formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | F8875 | |
| 880 Laser Scanning Confocal Airyscan Microscope | Carl Zeiss | ||
| 8-well imaging dishes | Ibidi | 80826 | |
| Anti-GFP alpaca GFP booster nanobody | Chromotek | gba-488 | |
| BD Influx Cell Sorter | BD Biosciences | ||
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cell Filters (70um) | Biofil | CSS010070 | |
| CellTrace Far Red | ThermoFisher Scientific | C34572 | |
| CellTrace Violet | ThermoFisher Scientific | C34571 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 31966021 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 10270-106 | |
| FluoTag-X2 anti-mScarlet-I alpaca nanobody | NanoTag Biotechnologies | N1302-At565 | |
| L15 CO2 independent imaging medium | Sigma-Aldrich | 21083027 | |
| Penicillin/streptomycin | Sigma-Aldrich | 15140122 | |
| Phenol red free DMEM, high glucose | ThermoFisher Scientific | 21063029 | |
| Phosphate buffered saline (1 x PBS) | 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2HPO4, dH2O up to 1L | ||
| Polyethylene Glycol Hybri-Max 1450 | Sigma-Aldrich | P7181 | |
| Polypropylene tubes | BD Falcon | 352063 | |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151 | nonionic surfactant |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Tween 20 | Fisher BioReagents | BP337 | nonionic detergent |
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