Célula-célula Fusión de Líneas Celulares Editadas genoma para la Perturbación de la Estructura Celular y la Función
Summary
El propósito de este protocolo es fusionar dos tipos de células diferentes para crear células híbridas. El análisis de microscopía de fluorescencia de células fusionadas se utiliza para rastrear la célula de origen de los orgánulos celulares. Este ensayo se puede utilizar para explorar cómo la estructura celular y la función responden a la perturbación por fusión celular.
Abstract
La vida se divide espacialmente dentro de las membranas lipídicas para permitir la formación aislada de estados moleculares distintos dentro de las células y orgánulos. La fusión celular es la fusión de dos o más celdas para formar una sola celda. Aquí proporcionamos un protocolo para la fusión celular de dos tipos de células diferentes. Las células híbridas fusionadas se enriquecen mediante la clasificación basada en citometría de flujo, seguida de la microscopía de fluorescencia de la estructura y función de las células híbridas. Las proteínas etiquetadas fluorescentes generadas por la edición del genoma se utilizan en el interior de las células fusionadas, lo que permite identificar las estructuras celulares en función de la emisión de fluorescencia y hacer referencia al tipo de origen de la célula. Este método robusto y general se puede aplicar a diferentes tipos de células u orgánulos de interés, para entender la estructura celular y la función a través de una gama de cuestiones biológicas fundamentales.
Introduction
El mantenimiento homeostático de la estructura celular es fundamental para la vida. Las células tienen morfologías características, números de orgánulos subcelulares y composición bioquímica interna. Entender cómo se generan estas propiedades fundamentales y cómo van mal durante la enfermedad requiere herramientas de laboratorio para perturbarlas.
La fusión celular es la fusión de dos o más celdas separadas. La fusión celular puede haber sido crítica para la aparición de la vida eucariota1. En el cuerpo humano, la fusión celular es relativamente rara, que ocurre durante circunstancias de desarrollo restringidas y tipos de tejido, como durante la fertilización o la formación de músculo, hueso y la placenta2. Este protocolo describe la inducción de la fusión célula-célula en líneas celulares de cultivo de tejido con orgánulos etiquetados fluorescentemente diferencialmente, como una herramienta para entender los mecanismos que controlan la estructura y la función celular.
La fusión in vitro de células celulares es fundamental para la producción de anticuerpos monoclonales3, una herramienta importante para la investigación biológica y el tratamiento de enfermedades. La fusión celular también se ha utilizado para hacer muchas preguntas biológicas fundamentales fundamentales sobre la dominancia del ciclo celular4, aneuploidía5,6, reprogramación celular7,8, la reparación de las neuronas dañadas9, proliferación viral10, apoptosis11, tumorigénesis12, dinámica citoesquelética13, y membrana de fusión14,15. Los métodos basados en laboratorio para inducir la fusión célula-célula16,17,18,19 inducen la carbonescencia de la membrana lipídica a través de la fusión física de dos bicapas en una. La fusión celular puede ser inducida por electricidad18, métodos virales basados17, calentamiento termoplasmónico20, expresión transgénica19, y productos químicos incluyendo polietilenglicol (PEG)16,21,22.
Los centros son centros organizadores de microtúbulos que controlan la forma celular, la motilidad, la polarización y la división23. Las raíces centrosómicas son estructuras fibrosas que se extienden a partir de centrosomas que contienen la proteína rootletina24 (codificada por el gen CROCC). Recientemente usamos la fusión de células celulares para entender cómo la posición y el número de centrosomas varían dentro de heterocaryons en relación con las células parentales24. La razón de ser de este método es rastrear la célula de origen de las raíces dentro de un heterokaryon después de la fusión de células parentales etiquetadas diferencialmente fluorescentes, y así imaginar la fusión y físsion de los orgánulos. Las proteínas etiquetadas fluorescentes rootletin-meGFP o rootletin-mScarlet-I se crean mediante la edición del genoma en líneas celulares separadas que luego se fusionan mediante la fusión celular mediada por PEG. Describimos el uso de tintes celulares(Tabla de Materiales)para identificar células fusionadas por citometría de flujo y posterior identificación microscópica de fluorescencia de células centrosomasdes de origen y morfología (Figura 1). Este enfoque es un método robusto y único para estudiar cómo los cambios importantes en el estado celular incluyendo el número de organélilos afectan a la homeostasis celular.
Protocol
Representative Results
Discussion
Demostramos un protocolo fácil y rentable para fusionar células y visualizar la arquitectura posterior de los híbridos celulares con microscopía, tardando aproximadamente dos días de principio a fin. Las partes críticas de este protocolo son el enriquecimiento de células fusionadas por clasificación celular (sección 3 del protocolo), y la validación cuidadosa de las células fusionadas por microscopía (sección 4 del protocolo). Estas secciones aseguran que las células fusionadas se obtengan fácilmente y sea…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por una beca Wellcome Trust Henry Wellcome a R.M. (https://wellcome.ac.uk/grant número 100090/12/Z). El fundero no tuvo ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito. Agradecemos a Ashok Venkitaraman y Paul French por su asesoramiento y orientación crítica sobre el proyecto. Agradecemos a Chiara Cossetti y Gabriela Grondys-Kotarba en las instalaciones de citometría Cambridge Institute for Medical Research Flow por su excelente apoyo. Agradecemos a Liam Cassiday, Thomas Miller y Gianmarco Contino por revisar el manuscrito.
Materials
| 15 ml tube | Sarstedt | 62554502 | |
| 37% formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | F8875 | |
| 880 Laser Scanning Confocal Airyscan Microscope | Carl Zeiss | ||
| 8-well imaging dishes | Ibidi | 80826 | |
| Anti-GFP alpaca GFP booster nanobody | Chromotek | gba-488 | |
| BD Influx Cell Sorter | BD Biosciences | ||
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cell Filters (70um) | Biofil | CSS010070 | |
| CellTrace Far Red | ThermoFisher Scientific | C34572 | |
| CellTrace Violet | ThermoFisher Scientific | C34571 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 31966021 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 10270-106 | |
| FluoTag-X2 anti-mScarlet-I alpaca nanobody | NanoTag Biotechnologies | N1302-At565 | |
| L15 CO2 independent imaging medium | Sigma-Aldrich | 21083027 | |
| Penicillin/streptomycin | Sigma-Aldrich | 15140122 | |
| Phenol red free DMEM, high glucose | ThermoFisher Scientific | 21063029 | |
| Phosphate buffered saline (1 x PBS) | 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2HPO4, dH2O up to 1L | ||
| Polyethylene Glycol Hybri-Max 1450 | Sigma-Aldrich | P7181 | |
| Polypropylene tubes | BD Falcon | 352063 | |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151 | nonionic surfactant |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Tween 20 | Fisher BioReagents | BP337 | nonionic detergent |
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