सेलुलर संरचना और समारोह के क्षोभ के लिए जीनोम संपादित सेल लाइनों के सेल सेल फ्यूजन
Summary
इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य हाइब्रिड कोशिकाओं को बनाने के लिए दो अलग-अलग सेल प्रकारों को फ्यूज करना है। सेलुलर ऑर्गेनेल्स की उत्पत्ति की कोशिका को ट्रैक करने के लिए फ्यूज्ड कोशिकाओं के फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी विश्लेषण का उपयोग किया जाता है। इस परख का उपयोग यह पता लगाने के लिए किया जा सकता है कि सेल फ्यूजन द्वारा क्षोभ का जवाब कैसे सेलुलर संरचना और कार्य करते हैं।
Abstract
जीवन को कोशिकाओं और ऑर्गेनेल्स के अंदर अलग-अलग आणविक राज्यों के अलग-अलग गठन की अनुमति देने के लिए लिपिड झिल्ली के भीतर स्थानिक रूप से विभाजित किया जाता है। सेल फ्यूजन एक ही सेल बनाने के लिए दो या दो से अधिक कोशिकाओं का विलय है। यहां हम दो अलग-अलग सेल प्रकारों के सेल फ्यूजन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। फ्यूज्ड हाइब्रिड कोशिकाएं फ्लो साइटोमेट्री-आधारित छंटाई से समृद्ध होती हैं, जिसके बाद हाइब्रिड सेल संरचना और कार्य की फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी होती है। जीनोम संपादन द्वारा उत्पन्न फ्लोरोसेंटी टैग किए गए प्रोटीन को फ्यूज्ड कोशिकाओं के अंदर चित्रित किया जाता है, जिससे सेलुलर संरचनाओं को फ्लोरेसेंस उत्सर्जन के आधार पर पहचाना जा सकता है और कोशिका प्रकार की उत्पत्ति के संदर्भ में वापस जाना जाता है। इस मजबूत और सामान्य विधि को विभिन्न सेल प्रकारों या ब्याज के ऑर्गेनेल्स पर लागू किया जा सकता है, ताकि सेलुलर संरचना को समझा जा सके और मौलिक जैविक प्रश्नों की एक श्रृंखला में कार्य किया जा सके।
Introduction
सेलुलर संरचना का होम्योस्टैटिक रखरखाव जीवन के लिए महत्वपूर्ण है। कोशिकाओं में विशिष्ट मॉर्फोलोजी, उप-सेलुलर ऑर्गेनेल नंबर और आंतरिक जैव रासायनिक संरचना होती है। यह समझना कि ये मौलिक गुण कैसे उत्पन्न होते हैं और रोग के दौरान वे कैसे धराशायी हो जाते हैं, उन्हें बेफिक्र करने के लिए प्रयोगशाला उपकरणों की आवश्यकता होती है।
सेल फ्यूजन दो या दो से अधिक अलग कोशिकाओं का विलय है। सेल फ्यूजन यूकेरियोटिक जीवन के उद्भव के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है1। मानव शरीर में, सेल संलयन अपेक्षाकृत दुर्लभ है, प्रतिबंधित विकासात्मक परिस्थितियों और ऊतक प्रकारों के दौरान होने वाली, जैसे निषेचन के दौरान या मांसपेशियों, हड्डी और प्लेसेंटा2का गठन। यह प्रोटोकॉल कोशिका संरचना और कार्य को नियंत्रित करने वाले तंत्रों को समझने के लिए एक उपकरण के रूप में, अलग-अलग फ्लोरोसेंटी लेबल ऑर्गेनेल्स के साथ ऊतक संस्कृति सेल लाइनों में सेल-सेल फ्यूजन को शामिल करने का वर्णन करता है।
इन विट्रो प्रेरित सेल-सेल फ्यूजन मोनोक्लोनल एंटीबॉडी3के उत्पादन के लिए केंद्रीय है, जो जैविक अनुसंधान और रोग उपचार के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है। सेल फ्यूजन का उपयोग सेल चक्र प्रभुत्व4, एन्यूप्लाइडी5,6, सेलुलर रीप्रोग्रामिंग7,8, क्षतिग्रस्त न्यूरॉन्स9, वायरल प्रसार10, एपोप्टोसिस11, ट्यूमरिजन12 , साइटोस्केलेटल डायनेमिक्स13और झिल्ली फ्यूजन14,15के बारे में कई अलग – अलग मौलिक कोशिका जैविक प्रश्न पूछने के लिए भी किया गया है । प्रयोगशाला आधारित तरीके सेल-सेल फ्यूजन16,17,18,19 को दो बाइलेयर के भौतिक विलय के माध्यम से लिपिड झिल्ली को संजाद करते हैं। सेल फ्यूजन को बिजली18,वायरल आधारित विधियों17,थर्मोप्लास्मोनिक हीटिंग20,ट्रांसजीन अभिव्यक्ति19और पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी)16,21,22सहित रसायनों से प्रेरित किया जा सकता है।
सेंट्रोसोम्स सेलुलर आकार, गतिशीलता, ध्रुवीकरण और डिवीजन23को नियंत्रित करने वाले माइक्रोट्यूबबुल आयोजन केंद्र हैं। सेंट्रोसोमल जड़ें प्रोटीन रूटलेटिन24 (जीन सीआरओसीसीद्वारा एन्कोड) युक्त सेंट्रोसोम्स से फैली रेशेदार संरचनाएं हैं। हमने हाल ही में सेल-सेल फ्यूजन का उपयोग यह समझने के लिए किया कि माता-पिता की कोशिकाओं24के सापेक्ष हेट्रोकेरियान के अंदर सेंट्रोसोम की स्थिति और संख्या कैसे भिन्न होती है। इस विधि के उपयोग के पीछे तर्क अलग फ्लोरोसेंटी टैग माता पिता की कोशिकाओं के संलयन के बाद एक विषमता के भीतर जड़ों की उत्पत्ति की कोशिका को ट्रैक करने के लिए है, और इस प्रकार छवि ऑर्गेनेल संलयन और विखंडन के लिए । फ्लोरोसेंटी टैग किए गए प्रोटीन रूटलेटिन-मेजीएफपी या रूटलेटिन-एमस्लेट-आई अलग सेल लाइनों में जीनोम संपादन द्वारा बनाए जाते हैं जो तब खूंटी-मध्यस्थता सेल फ्यूजन द्वारा जुड़े होते हैं। हम कोशिका रंगों(सामग्री की तालिका)के उपयोग का वर्णन करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री और बाद में फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी पहचान मूल और आकृति विज्ञान(चित्रा 1)के सेंट्रोसोम सेल की पहचान द्वारा जुड़े कोशिकाओं की पहचान करने के लिए । यह दृष्टिकोण यह अध्ययन करने के लिए एक मजबूत और अनूठी विधि है कि सेल होमोस्टोसिस पर ऑर्गेनेल नंबर सहित सेलुलर राज्य में बड़े बदलाव कैसे होते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
हम कोशिकाओं को फ्यूज करने और माइक्रोस्कोपी के साथ सेल हाइब्रिड के बाद के वास्तुकला की कल्पना करने के लिए एक फेसियल और लागत प्रभावी प्रोटोकॉल प्रदर्शित करते हैं, जो शुरू से खत्म होने में लगभग दो दिन लगत?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को एक वेलकम ट्रस्ट हेनरी वेलकम फैलोशिप द्वारा आरएम (https://wellcome.ac.uk/grant नंबर 100090/12/Z) के लिए वित्त पोषित किया गया था । अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने या पांडुलिपि की तैयारी में funder की कोई भूमिका नहीं थी। हम इस परियोजना पर महत्वपूर्ण सलाह और मार्गदर्शन के लिए अशोक वेंकितारमण और पॉल फ्रेंच को धन्यवाद देते हैं । हम उत्कृष्ट समर्थन के लिए कैंब्रिज इंस्टीट्यूट फॉर मेडिकल रिसर्च फ्लो साइटोमेट्री सुविधा में चियारा कोसेट्टी और गैब्रिएला ग्रोनडिस-कोटरबा का शुक्रिया अदा करते हैं । हम पांडुलिपि को प्रूफरीडिंग के लिए लियाम कैसिडे, थॉमस मिलर और गिनामार्को कोंटिनो को धन्यवाद देते हैं।
Materials
| 15 ml tube | Sarstedt | 62554502 | |
| 37% formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | F8875 | |
| 880 Laser Scanning Confocal Airyscan Microscope | Carl Zeiss | ||
| 8-well imaging dishes | Ibidi | 80826 | |
| Anti-GFP alpaca GFP booster nanobody | Chromotek | gba-488 | |
| BD Influx Cell Sorter | BD Biosciences | ||
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cell Filters (70um) | Biofil | CSS010070 | |
| CellTrace Far Red | ThermoFisher Scientific | C34572 | |
| CellTrace Violet | ThermoFisher Scientific | C34571 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 31966021 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 10270-106 | |
| FluoTag-X2 anti-mScarlet-I alpaca nanobody | NanoTag Biotechnologies | N1302-At565 | |
| L15 CO2 independent imaging medium | Sigma-Aldrich | 21083027 | |
| Penicillin/streptomycin | Sigma-Aldrich | 15140122 | |
| Phenol red free DMEM, high glucose | ThermoFisher Scientific | 21063029 | |
| Phosphate buffered saline (1 x PBS) | 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2HPO4, dH2O up to 1L | ||
| Polyethylene Glycol Hybri-Max 1450 | Sigma-Aldrich | P7181 | |
| Polypropylene tubes | BD Falcon | 352063 | |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151 | nonionic surfactant |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Tween 20 | Fisher BioReagents | BP337 | nonionic detergent |
References
- Lane, N. . Power, Sex, Suicide: Mitochondria and the meaning of life. , (2006).
- Brukman, N. G., Uygur, B., Podbilewicz, B., Chernomordik, L. V. How cells fuse. The Journal of Cell Biology. 218 (5), 1436-1451 (2019).
- Köhler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).
- Rao, P. N., Johnson, R. T. Mammalian Cell Fusion: Studies on the Regulation of DNA Synthesis and Mitosis. Nature. 225 (5228), 159-164 (1970).
- Lengauer, C., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Genetic instability in colorectal cancers. Nature. 386 (6625), 623-627 (1997).
- Fournier, R. E., Ruddle, F. H. Microcell-mediated transfer of murine chromosomes into mouse, Chinese hamster, and human somatic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (1), 319-323 (1977).
- Tada, M., Tada, T., Lefebvre, L., Barton, S. C., Surani, M. A. Embryonic germ cells induce epigenetic reprogramming of somatic nucleus in hybrid cells. The EMBO Journal. 16 (21), 6510-6520 (1997).
- Skelley, A. M., Kirak, O., Suh, H., Jaenisch, R., Voldman, J. Microfluidic control of cell pairing and fusion. Nature Methods. 6 (2), 147-152 (2009).
- Donaldson, J., Shi, R., Borgens, R. Polyethylene glycol rapidly restores physiological functions in damaged sciatic nerves of guinea pigs. Neurosurgery. 50 (1), 147-157 (2002).
- Duelli, D. M., Hearn, S., Myers, M. P., Lazebnik, Y. A primate virus generates transformed human cells by fusion. The Journal of Cell Biology. 171 (3), 493-503 (2005).
- Duelli, D. M., Lazebnik, Y. A. Primary cells suppress oncogene-dependent apoptosis. Nature Cell Biology. 2 (11), 859-862 (2000).
- Duelli, D. M., et al. A virus causes cancer by inducing massive chromosomal instability through cell fusion. Current Biology. 17 (5), 431-437 (2007).
- Paramio, J. M., Casanova, M. L., Alonso, A., Jorcano, J. L. Keratin intermediate filament dynamics in cell heterokaryons reveals diverse behaviour of different keratins. Journal of Cell Science. 110, 1099-1111 (1997).
- Lentz, B. R. PEG as a tool to gain insight into membrane fusion. European Biophysics Journal. 36 (4-5), 315-326 (2007).
- Lentz, B. R., Lee, J. K. Poly(ethylene glycol) (PEG)-mediated fusion between pure lipid bilayers: a mechanism in common with viral fusion and secretory vesicle release?. Molecular Membrane Biology. 16 (4), 279-296 (1999).
- Pontecorvo, G. Production of mammalian somatic cell hybrids by means of polyethylene glycol treatment. Somatic Cell Genetics. 1 (4), 397-400 (1975).
- Okada, Y. Analysis of giant polynuclear cell formation caused by HVJ virus from Ehrlich’s ascites tumor cells. I. Microscopic observation of giant polynuclear cell formation. Experimental Cell Research. 26, 98-107 (1962).
- Zimmermann, U. Electric field-mediated fusion and related electrical phenomena. Biochimica et Biophysica Acta. 694 (3), 227-277 (1982).
- Hu, C., et al. Fusion of cells by flipped SNAREs. Science. 300 (5626), 1745-1749 (2003).
- Bahadori, A., Lund, A. R., Semsey, S., Oddershede, L. B., Bendix, P. M. Controlled cellular fusion using optically trapped plasmonic nano-heaters. Optical Trapping and Optical Micromanipulation XIII. 9922, 992211 (2016).
- Kao, K. N., Michayluk, M. R. A method for high-frequency intergeneric fusion of plant protoplasts. Planta. 115 (4), 355-367 (1974).
- Ahkong, Q. F., Fisher, D., Tampion, W., Lucy, J. A. Mechanisms of cell fusion. Nature. 253 (5488), 194-195 (1975).
- Mahen, R., Venkitaraman, A. R. Pattern formation in centrosome assembly. Current Opinion in Cell Biology. 24 (1), 14-23 (2012).
- Mahen, R. Stable centrosomal roots disentangle to allow interphase centriole independence. PLoS Biology. 16 (4), e2003998 (2018).
- Mahen, R., et al. Comparative assessment of fluorescent transgene methods for quantitative imaging in human cells. Molecular Biology of the Cell. 25 (22), 3610-3618 (2014).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Yang, J., Shen, M. H. Polyethylene glycol-mediated cell fusion. Methods in Molecular Biology. 325, 59-66 (2006).
- Huang, L., Chen, Y., Huang, W., Wu, H. Cell pairing and polyethylene glycol (PEG)-mediated cell fusion using two-step centrifugation-assisted single-cell trapping (CAScT). Lab on a Chip. 18 (7), 1113-1120 (2018).
- Feliciano, D., Nixon-Abell, J., Lippincott-Schwartz, J. Triggered Cell-Cell Fusion Assay for Cytoplasmic and Organelle Intermixing Studies. Current Protocols in Cell Biology. 81 (1), e61 (2018).
- Vaughan, V. L., Hansen, D., Stadler, J. Parameters of polyethylene glycol-induced cell fusion and hybridization in lymphoid cell lines. Somatic Cell Genetics. 2 (6), 537-544 (1976).
- Frye, L. D., Edidin, M. The rapid intermixing of cell surface antigens after formation of mouse-human heterokaryons. Journal of Cell Science. 7 (2), 319-335 (1970).
- Mattenberger, Y., James, D. I., Martinou, J. C. Fusion of mitochondria in mammalian cells is dependent on the mitochondrial inner membrane potential and independent of microtubules or actin. FEBS Letters. 538 (1-3), 53-59 (2003).
- Kerbel, R. S., Lagarde, A. E., Dennis, J. W., Donaghue, T. P. Spontaneous fusion in vivo between normal host and tumor cells: possible contribution to tumor progression and metastasis studied with a lectin-resistant mutant tumor. Molecular and Cellular Biology. 3 (4), 523-538 (1983).
