Formålet med denne protokollen er å fusjonere to forskjellige celletyper for å opprette hybride celler. Fluorescens mikroskopi analyse av smeltet celler brukes til å spore cellen av opprinnelsen til mobilnettet organeller. Denne analysen kan brukes til å utforske hvordan cellulære struktur og funksjon reagerer på forstyrrelsene av celle fusjon.
Livet er romlig partisjonert innen lipid membraner for å tillate isolert dannelse av distinkte molekylære tilstander inne celler og organeller. Celle fusjon er sammenslåingen av to eller flere celler for å danne en enkelt celle. Her gir vi en protokoll for celle fusjon av to forskjellige celletyper. Smeltet hybrid celler er beriket av Flow flowcytometri-basert sortering, etterfulgt av fluorescens mikroskopi av hybrid cellestruktur og funksjon. Fluorescensmerkete Tagged proteiner generert av Genova redigering er avbildet inne smeltet celler, slik at cellulære strukturer for å bli identifisert basert på fluorescens utslipp og referert tilbake til cellen type opprinnelse. Denne robuste og generelle metoden kan brukes på ulike celletyper eller organeller av interesse, for å forstå cellulære struktur og funksjon på tvers av en rekke grunnleggende biologiske spørsmål.
Homøostatisk vedlikehold av cellulær struktur er avgjørende for livet. Celler har karakteristiske morfologier, sub-cellulære organelle tall, og interne biokjemiske sammensetning. Forstå hvordan disse fundamentale egenskapene er generert og hvordan de går galt under sykdom krever laboratorie verktøy for å forurolige dem.
Celle fusjon er sammenslåing av to eller flere separate celler. Celle fusjon kan ha vært avgjørende for fremveksten av eukaryote liv1. I menneskekroppen, celle fusjon er relativt sjelden, forekommer under begrenset utviklings forhold og vevstyper, slik som under befruktning eller dannelsen av muskler, bein og morkaken2. Denne protokollen beskriver induksjon av celle-celle fusjon i vev kultur cellelinjer med differensielt fluorescensmerkete merket organeller, som et verktøy for å forstå mekanismene kontrollerende cellestruktur og funksjon.
I vitro indusert celle-celle fusjon er sentralt i produksjonen av monoklonale antistoffer3, et viktig verktøy for biologisk forskning og sykdomsbehandling. Cell Fusion har også blitt brukt til å spørre mange forskjellige grunnleggende celle biologiske spørsmål om celle syklus dominans4,avvik,omprogrammering, cellular,reparasjonav skadede neurons9, viral spredning10, apoptose11, tumorigenesis12, cytoskjelettkomponenter Dynamics13, og membran Fusion14,15. Laboratorie baserte metoder for å indusere celle-Cell Fusion16,17,18,19 indusere lipid membran Koalesens gjennom den fysiske sammenslåing av to bilayers i ett. Cell Fusion kan bli indusert av elektrisitet18, viral baserte metoder17, thermoplasmonic oppvarming20, transgene Expression19, og kjemikalier inkludert polyetylen glykol (PEG)16,21,22.
Centrosomes er mikrotubulinettverket organisering sentre kontrollerende cellulær form, motilitet, polarisering, og divisjon23. Centrosomal røtter er fiber strukturer som strekker seg fra centrosomes som inneholder proteinet rootletin24 (kodet av genet CROCC). Vi har nylig brukt celle-celle fusjon for å forstå hvordan centrosome posisjon og antall varierer inne heterokaryons forhold til foreldrenes celler24. Begrunnelsen bak bruken av denne metoden er å spore cellen opprinnelse røtter innenfor en heterokaryon etter fusjon av differensielt fluorescensmerkete merkede foreldrenes celler, og dermed til bilde organelle fusjon og fisjon. Den fluorescensmerkete merket proteiner rootletin-meGFP eller rootletin-mScarlet-jeg er skapt av Genova redigering i separate cellelinjer som deretter smeltet sammen med PEG-mediert celle fusjon. Vi beskriver bruken av cellefarge stoffer (tabell av materialer) for å identifisere smeltet celler ved flyt flowcytometri og påfølgende fluorescens mikroskopi identifisering av centrosome celle av opprinnelse og morfologi (figur 1). Denne tilnærmingen er en robust og unik metode for å studere hvordan store endringer i mobilnettet stat inkludert organelle nummer impinge på celle homeostase.
Vi viser en facile og kostnadseffektiv protokoll for fiksering celler og visualisere den påfølgende arkitekturen av celle hybrider med mikroskopi, tar ca to dager fra Start til slutt. Kritiske deler av denne protokollen er berikelse av smeltet celler ved celle sortering (protokoll del 3), og forsiktig validering av smeltet celler ved mikroskopi (protokoll seksjon 4). Disse seksjonene sikre at smeltet celler er lett innhentet og er bona fide heterokaryons. Konsentrasjoner og inkubasjons tider bør overholdes. Når det f…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble finansiert av en Wellcome tillit Henry Wellcome Fellowship til RM (https://wellcome.ac.uk/grant nummer 100090/12/Z). Funder hadde ingen rolle i studien design, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Vi takker Ashok Venkitaraman og Paul fransk for kritiske råd og veiledning om prosjektet. Vi takker Chiara Cossetti og Gabriela Grondys-Kotarba i Cambridge Institute for Medical Research Flow flowcytometri anlegg for utmerket støtte. Vi takker Liam Cassiday, Thomas Miller, og Gianmarco Contino for korrekturlesing manuskriptet.
15 ml tube | Sarstedt | 62554502 | |
37% formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | F8875 | |
880 Laser Scanning Confocal Airyscan Microscope | Carl Zeiss | ||
8-well imaging dishes | Ibidi | 80826 | |
Anti-GFP alpaca GFP booster nanobody | Chromotek | gba-488 | |
BD Influx Cell Sorter | BD Biosciences | ||
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
Cell Filters (70um) | Biofil | CSS010070 | |
CellTrace Far Red | ThermoFisher Scientific | C34572 | |
CellTrace Violet | ThermoFisher Scientific | C34571 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 31966021 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 10270-106 | |
FluoTag-X2 anti-mScarlet-I alpaca nanobody | NanoTag Biotechnologies | N1302-At565 | |
L15 CO2 independent imaging medium | Sigma-Aldrich | 21083027 | |
Penicillin/streptomycin | Sigma-Aldrich | 15140122 | |
Phenol red free DMEM, high glucose | ThermoFisher Scientific | 21063029 | |
Phosphate buffered saline (1 x PBS) | 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2HPO4, dH2O up to 1L | ||
Polyethylene Glycol Hybri-Max 1450 | Sigma-Aldrich | P7181 | |
Polypropylene tubes | BD Falcon | 352063 | |
Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151 | nonionic surfactant |
Trypsin | Sigma-Aldrich | T4049 | |
Tween 20 | Fisher BioReagents | BP337 | nonionic detergent |