Cellen-cellen smelting av Genova redigert cellen linjer for forstyrrelsene av Cellular struktur og funksjonen
Summary
Formålet med denne protokollen er å fusjonere to forskjellige celletyper for å opprette hybride celler. Fluorescens mikroskopi analyse av smeltet celler brukes til å spore cellen av opprinnelsen til mobilnettet organeller. Denne analysen kan brukes til å utforske hvordan cellulære struktur og funksjon reagerer på forstyrrelsene av celle fusjon.
Abstract
Livet er romlig partisjonert innen lipid membraner for å tillate isolert dannelse av distinkte molekylære tilstander inne celler og organeller. Celle fusjon er sammenslåingen av to eller flere celler for å danne en enkelt celle. Her gir vi en protokoll for celle fusjon av to forskjellige celletyper. Smeltet hybrid celler er beriket av Flow flowcytometri-basert sortering, etterfulgt av fluorescens mikroskopi av hybrid cellestruktur og funksjon. Fluorescensmerkete Tagged proteiner generert av Genova redigering er avbildet inne smeltet celler, slik at cellulære strukturer for å bli identifisert basert på fluorescens utslipp og referert tilbake til cellen type opprinnelse. Denne robuste og generelle metoden kan brukes på ulike celletyper eller organeller av interesse, for å forstå cellulære struktur og funksjon på tvers av en rekke grunnleggende biologiske spørsmål.
Introduction
Homøostatisk vedlikehold av cellulær struktur er avgjørende for livet. Celler har karakteristiske morfologier, sub-cellulære organelle tall, og interne biokjemiske sammensetning. Forstå hvordan disse fundamentale egenskapene er generert og hvordan de går galt under sykdom krever laboratorie verktøy for å forurolige dem.
Celle fusjon er sammenslåing av to eller flere separate celler. Celle fusjon kan ha vært avgjørende for fremveksten av eukaryote liv1. I menneskekroppen, celle fusjon er relativt sjelden, forekommer under begrenset utviklings forhold og vevstyper, slik som under befruktning eller dannelsen av muskler, bein og morkaken2. Denne protokollen beskriver induksjon av celle-celle fusjon i vev kultur cellelinjer med differensielt fluorescensmerkete merket organeller, som et verktøy for å forstå mekanismene kontrollerende cellestruktur og funksjon.
I vitro indusert celle-celle fusjon er sentralt i produksjonen av monoklonale antistoffer3, et viktig verktøy for biologisk forskning og sykdomsbehandling. Cell Fusion har også blitt brukt til å spørre mange forskjellige grunnleggende celle biologiske spørsmål om celle syklus dominans4,avvik,omprogrammering, cellular,reparasjonav skadede neurons9, viral spredning10, apoptose11, tumorigenesis12, cytoskjelettkomponenter Dynamics13, og membran Fusion14,15. Laboratorie baserte metoder for å indusere celle-Cell Fusion16,17,18,19 indusere lipid membran Koalesens gjennom den fysiske sammenslåing av to bilayers i ett. Cell Fusion kan bli indusert av elektrisitet18, viral baserte metoder17, thermoplasmonic oppvarming20, transgene Expression19, og kjemikalier inkludert polyetylen glykol (PEG)16,21,22.
Centrosomes er mikrotubulinettverket organisering sentre kontrollerende cellulær form, motilitet, polarisering, og divisjon23. Centrosomal røtter er fiber strukturer som strekker seg fra centrosomes som inneholder proteinet rootletin24 (kodet av genet CROCC). Vi har nylig brukt celle-celle fusjon for å forstå hvordan centrosome posisjon og antall varierer inne heterokaryons forhold til foreldrenes celler24. Begrunnelsen bak bruken av denne metoden er å spore cellen opprinnelse røtter innenfor en heterokaryon etter fusjon av differensielt fluorescensmerkete merkede foreldrenes celler, og dermed til bilde organelle fusjon og fisjon. Den fluorescensmerkete merket proteiner rootletin-meGFP eller rootletin-mScarlet-jeg er skapt av Genova redigering i separate cellelinjer som deretter smeltet sammen med PEG-mediert celle fusjon. Vi beskriver bruken av cellefarge stoffer (tabell av materialer) for å identifisere smeltet celler ved flyt flowcytometri og påfølgende fluorescens mikroskopi identifisering av centrosome celle av opprinnelse og morfologi (figur 1). Denne tilnærmingen er en robust og unik metode for å studere hvordan store endringer i mobilnettet stat inkludert organelle nummer impinge på celle homeostase.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi viser en facile og kostnadseffektiv protokoll for fiksering celler og visualisere den påfølgende arkitekturen av celle hybrider med mikroskopi, tar ca to dager fra Start til slutt. Kritiske deler av denne protokollen er berikelse av smeltet celler ved celle sortering (protokoll del 3), og forsiktig validering av smeltet celler ved mikroskopi (protokoll seksjon 4). Disse seksjonene sikre at smeltet celler er lett innhentet og er bona fide heterokaryons. Konsentrasjoner og inkubasjons tider bør overholdes. Når det f…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble finansiert av en Wellcome tillit Henry Wellcome Fellowship til RM (https://wellcome.ac.uk/grant nummer 100090/12/Z). Funder hadde ingen rolle i studien design, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Vi takker Ashok Venkitaraman og Paul fransk for kritiske råd og veiledning om prosjektet. Vi takker Chiara Cossetti og Gabriela Grondys-Kotarba i Cambridge Institute for Medical Research Flow flowcytometri anlegg for utmerket støtte. Vi takker Liam Cassiday, Thomas Miller, og Gianmarco Contino for korrekturlesing manuskriptet.
Materials
| 15 ml tube | Sarstedt | 62554502 | |
| 37% formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | F8875 | |
| 880 Laser Scanning Confocal Airyscan Microscope | Carl Zeiss | ||
| 8-well imaging dishes | Ibidi | 80826 | |
| Anti-GFP alpaca GFP booster nanobody | Chromotek | gba-488 | |
| BD Influx Cell Sorter | BD Biosciences | ||
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cell Filters (70um) | Biofil | CSS010070 | |
| CellTrace Far Red | ThermoFisher Scientific | C34572 | |
| CellTrace Violet | ThermoFisher Scientific | C34571 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 31966021 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 10270-106 | |
| FluoTag-X2 anti-mScarlet-I alpaca nanobody | NanoTag Biotechnologies | N1302-At565 | |
| L15 CO2 independent imaging medium | Sigma-Aldrich | 21083027 | |
| Penicillin/streptomycin | Sigma-Aldrich | 15140122 | |
| Phenol red free DMEM, high glucose | ThermoFisher Scientific | 21063029 | |
| Phosphate buffered saline (1 x PBS) | 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2HPO4, dH2O up to 1L | ||
| Polyethylene Glycol Hybri-Max 1450 | Sigma-Aldrich | P7181 | |
| Polypropylene tubes | BD Falcon | 352063 | |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151 | nonionic surfactant |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Tween 20 | Fisher BioReagents | BP337 | nonionic detergent |
References
- Lane, N. . Power, Sex, Suicide: Mitochondria and the meaning of life. , (2006).
- Brukman, N. G., Uygur, B., Podbilewicz, B., Chernomordik, L. V. How cells fuse. The Journal of Cell Biology. 218 (5), 1436-1451 (2019).
- Köhler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).
- Rao, P. N., Johnson, R. T. Mammalian Cell Fusion: Studies on the Regulation of DNA Synthesis and Mitosis. Nature. 225 (5228), 159-164 (1970).
- Lengauer, C., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Genetic instability in colorectal cancers. Nature. 386 (6625), 623-627 (1997).
- Fournier, R. E., Ruddle, F. H. Microcell-mediated transfer of murine chromosomes into mouse, Chinese hamster, and human somatic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (1), 319-323 (1977).
- Tada, M., Tada, T., Lefebvre, L., Barton, S. C., Surani, M. A. Embryonic germ cells induce epigenetic reprogramming of somatic nucleus in hybrid cells. The EMBO Journal. 16 (21), 6510-6520 (1997).
- Skelley, A. M., Kirak, O., Suh, H., Jaenisch, R., Voldman, J. Microfluidic control of cell pairing and fusion. Nature Methods. 6 (2), 147-152 (2009).
- Donaldson, J., Shi, R., Borgens, R. Polyethylene glycol rapidly restores physiological functions in damaged sciatic nerves of guinea pigs. Neurosurgery. 50 (1), 147-157 (2002).
- Duelli, D. M., Hearn, S., Myers, M. P., Lazebnik, Y. A primate virus generates transformed human cells by fusion. The Journal of Cell Biology. 171 (3), 493-503 (2005).
- Duelli, D. M., Lazebnik, Y. A. Primary cells suppress oncogene-dependent apoptosis. Nature Cell Biology. 2 (11), 859-862 (2000).
- Duelli, D. M., et al. A virus causes cancer by inducing massive chromosomal instability through cell fusion. Current Biology. 17 (5), 431-437 (2007).
- Paramio, J. M., Casanova, M. L., Alonso, A., Jorcano, J. L. Keratin intermediate filament dynamics in cell heterokaryons reveals diverse behaviour of different keratins. Journal of Cell Science. 110, 1099-1111 (1997).
- Lentz, B. R. PEG as a tool to gain insight into membrane fusion. European Biophysics Journal. 36 (4-5), 315-326 (2007).
- Lentz, B. R., Lee, J. K. Poly(ethylene glycol) (PEG)-mediated fusion between pure lipid bilayers: a mechanism in common with viral fusion and secretory vesicle release?. Molecular Membrane Biology. 16 (4), 279-296 (1999).
- Pontecorvo, G. Production of mammalian somatic cell hybrids by means of polyethylene glycol treatment. Somatic Cell Genetics. 1 (4), 397-400 (1975).
- Okada, Y. Analysis of giant polynuclear cell formation caused by HVJ virus from Ehrlich’s ascites tumor cells. I. Microscopic observation of giant polynuclear cell formation. Experimental Cell Research. 26, 98-107 (1962).
- Zimmermann, U. Electric field-mediated fusion and related electrical phenomena. Biochimica et Biophysica Acta. 694 (3), 227-277 (1982).
- Hu, C., et al. Fusion of cells by flipped SNAREs. Science. 300 (5626), 1745-1749 (2003).
- Bahadori, A., Lund, A. R., Semsey, S., Oddershede, L. B., Bendix, P. M. Controlled cellular fusion using optically trapped plasmonic nano-heaters. Optical Trapping and Optical Micromanipulation XIII. 9922, 992211 (2016).
- Kao, K. N., Michayluk, M. R. A method for high-frequency intergeneric fusion of plant protoplasts. Planta. 115 (4), 355-367 (1974).
- Ahkong, Q. F., Fisher, D., Tampion, W., Lucy, J. A. Mechanisms of cell fusion. Nature. 253 (5488), 194-195 (1975).
- Mahen, R., Venkitaraman, A. R. Pattern formation in centrosome assembly. Current Opinion in Cell Biology. 24 (1), 14-23 (2012).
- Mahen, R. Stable centrosomal roots disentangle to allow interphase centriole independence. PLoS Biology. 16 (4), e2003998 (2018).
- Mahen, R., et al. Comparative assessment of fluorescent transgene methods for quantitative imaging in human cells. Molecular Biology of the Cell. 25 (22), 3610-3618 (2014).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Yang, J., Shen, M. H. Polyethylene glycol-mediated cell fusion. Methods in Molecular Biology. 325, 59-66 (2006).
- Huang, L., Chen, Y., Huang, W., Wu, H. Cell pairing and polyethylene glycol (PEG)-mediated cell fusion using two-step centrifugation-assisted single-cell trapping (CAScT). Lab on a Chip. 18 (7), 1113-1120 (2018).
- Feliciano, D., Nixon-Abell, J., Lippincott-Schwartz, J. Triggered Cell-Cell Fusion Assay for Cytoplasmic and Organelle Intermixing Studies. Current Protocols in Cell Biology. 81 (1), e61 (2018).
- Vaughan, V. L., Hansen, D., Stadler, J. Parameters of polyethylene glycol-induced cell fusion and hybridization in lymphoid cell lines. Somatic Cell Genetics. 2 (6), 537-544 (1976).
- Frye, L. D., Edidin, M. The rapid intermixing of cell surface antigens after formation of mouse-human heterokaryons. Journal of Cell Science. 7 (2), 319-335 (1970).
- Mattenberger, Y., James, D. I., Martinou, J. C. Fusion of mitochondria in mammalian cells is dependent on the mitochondrial inner membrane potential and independent of microtubules or actin. FEBS Letters. 538 (1-3), 53-59 (2003).
- Kerbel, R. S., Lagarde, A. E., Dennis, J. W., Donaghue, T. P. Spontaneous fusion in vivo between normal host and tumor cells: possible contribution to tumor progression and metastasis studied with a lectin-resistant mutant tumor. Molecular and Cellular Biology. 3 (4), 523-538 (1983).
