في تعزيز فيفو الموجه الهضمية التعريفي خليه T الاستقراء
Summary
هنا نقدم بروتوكول لزيادة الجسم الحي من الموجه الهضمية التعريفي الخلية T. في هذا البروتوكول ، يتم تصميم الخلايا الجذعية لإنتاج محليا تركيزات عاليه من فيتامين D النشط (1 ، 25-ديهيدروكسي فيتامين D أو 1 ، 25 [OH]2د) وفيتامين A النشط (حمض الريتينويك أو RA) دي نوفو.
Abstract
مرض التهاب الأمعاء (IBD) هو مرض التهابي مزمن في الجهاز الهضمي (GUT). في الولايات المتحدة الامريكيه, هناك تقريبا 1,400,000 [أبد] مريضات. ومن المقبول عموما ان الاستجابة المناعية dysregulated لبكتيريا الأمعاء يبدا المرض ويعطل الحاجز الظهاريه المخاطية. وقد أظهرنا مؤخرا ان خلايا T (Treg) التنظيمية الموجهة للأمعاء هي علاج واعد لل IBD. ووفقا لذلك ، يقدم هذا المقال بروتوكولا لزيادة الجسم المجري لحث الخلية Treg الموجه الأمعاء. في هذا البروتوكول ، تم تصميم الخلايا الجذعية لإنتاج تركيزات عاليه محليا من جزيئات من نوفو ، فيتامين D النشط (1 ، 25-ثنائي هيدروكسي فيتامين D أو 1 ، 25 [OH]2D) وفيتامين A النشط (حمض الريتينويك أو RA). اخترنا 1, 25 (OH)2d و ra استنادا إلى النتائج السابقة التي تبين ان 1, 25 (oh)2d يمكن ان تحفز التعبير عن الجزيئات التنظيمية (علي سبيل المثال ، فورخياد box P3 و interleukin-10) وان ra يمكن ان تحفز التعبير عن مستقبلات الأمعاء الموجه في الخلايا T. لتوليد مثل هذه الخلايا الجذعية المهندسة ، ونحن نستخدم متجه لينتيفيرال لتحويل الخلايا الجذعية إلى overexpress اثنين من الجينات. واحده مورثه ال [سيتوكروم] P450 أسره 27 [سوبف# اميلي] [ب] عضوه 1 ان [اينسلس] [25-هيدروكسيفيتامين د] [1 α-هيدروكسيلاز], اي [فيولوجكلي] يحفز التوليف من 1, 25 ([آه])2[د]. الجين الآخر هو ديجينداز الدهيد 1 فرد الاسره A2 ان الرموز الريديوالدهيد ديجينتاز 2, الذي يحفز فسيولوجيا تخليق RA. ويمكن استخدام هذا البروتوكول للتحقيق في المستقبل من خلايا Treg القناة الهضمية في الجسم المجري.
Introduction
مرض التهاب الأمعاء (IBD) هو مرض التهابي مزمن في الجهاز الهضمي (GUT). في الولايات المتحدة الامريكيه, هناك تقريبا 1,400,000 [أبد] مريضات. ومن المقبول عموما ان الاستجابة المناعية dysregulated لبكتيريا الأمعاء يبدا المرض ويعطل الحاجز الظهاريه المخاطية1,2. ولهذا السبب ، فان الادويه التي وافقت عليها أداره الغذاء والدواء الامريكيه (FDA) المعتمدة حاليا تمنع وظائف الوسطاء التهابيين أو تمنع الخلايا المناعية من الحصول علي الأمعاء. ومع ذلك ، فان الوسطاء التهابيين والخلايا المناعية التي يتم استهدافها ضرورية أيضا للدفاعات المناعية. ونتيجة لذلك ، فان مثبطات الوسيط التهابيه تنال من الدفاع المناعي الجهازي ، وتضعف حاصرات الخلية المناعية من الدفاع المناعي للأمعاء ، وكلاهما يمكن ان يؤدي إلى عواقب وخيمه3،4. الاضافه إلى ذلك ، فان حاصرات موجه الخلية المناعية يمكن أيضا منع الموجه من الخلايا T (Treg) التنظيمية في القناة الهضمية ، التالي يمكن ان تتفاقم التسامح المناعي الأمعاء المهددة بالفعل في المرضي IBD. وعلاوة علي ذلك ، فان حجب الخلية الموجهة إلى الأمعاء قد يؤدي أيضا إلى كبت المناعة الجهازية بسبب تراكم خلايا Treg في الدم5. وأخيرا ، فان مثبطات وموانع وظيفة متعديه ، التالي ، تتطلب إدارات متكررة. الاداره المتكررة لهذه المثبطات والحاصرات قد تزيد من تفاقم الآثار الجانبية غير المرغوب فيها.
في الاونه الاخيره ، اقترحنا استراتيجية جديده يمكن ان تخفف أو حتى القضاء علي الآثار الجانبية المرتبطة بالادويه الحالية لعلاج IBD6. وهذه الاستراتيجية تقوي التحريض علي خلايا Treg الموجهة للأمعاء في الانسجه اللمفاوية الطرفية6. الأساس المنطقي لهذه الاستراتيجية هو ان خلايا Treg الموجهة إلى الأمعاء المنزل علي وجه التحديد إلى القناة الهضمية ، التالي لن يضر الدفاعات المناعية الجهازية. الاضافه إلى ذلك ، نظرا لان الخلايا treg يمكن ان تشكل الذاكرة7،8، القناة الهضمية الموجه الخلايا treg يمكن ان توفر السيطرة مستقره من التهاب الأمعاء المزمن في المرضي ibd ، التالي ، يجب ان لا تحتاج إلى ان تدار العلاج كما في كثير من الأحيان. وعلاوة علي ذلك ، نظرا لان هذه الاستراتيجية تزيد من تحريض خلايا الأمعاء الموجهة في الجسم الفيفو ، فانها لا تشعر بالقلق في عدم الاستقرار المجري في بيئة عاليه التهابات المرتبطة بالتبني نقل الخلايا treg المتولدة في المختبر9,10. في هذا الصدد ، في المختبر توليد خلايا treg هي واحده من الاستراتيجيات المقترحة لعلاج امراض المناعة الذاتية11،12،13 وزرع الرفض14،15. وأخيرا ، في هذه الاستراتيجية ، تم تصميم الخلايا الجذعية (DCs) لإنتاج تركيزات عاليه محليا من اثنين من جزيئات من نوفو: فيتامين D النشط (1 ، 25-ديهيدروكسي فيتامين D أو 1 ، 25 [OH]2د) وفيتامين A النشط (حمض الريتينويك أو RA). اخترنا 1, 25 (oh)2d و RA لان 1, 25 (oh)2d يمكن ان تحفز علي التعبير عن الجزيئات التنظيمية (علي سبيل المثال ، فورخيد box P3 [foxp3] و interleukin-10 [آيل-10])16,17 وان RA يمكن ان تحفز التعبير عن مستقبلات الأمعاء الموجه في الخلايا T18. لان كلا 1, 25 (OH)2D و RA يمكن أيضا تحمل dcs28,29, ونحن السبب في ان dcs المهندسة سيتم الاحتفاظ بثبات في حاله التحمل في الجسم الفيفو ، التالي التفاف في المخاوف عدم الاستقرار التي ترتبط في المختبر التي ولدت التسامح dc (toldcs)19,20,21. وفي هذا الصدد ، toldcs هي أيضا واحده من الاستراتيجيات المقترحة لتعزيز الجسم الخلوي لوظائف الخلية treg19،20،21. لدعم المنطق لدينا ، وقد أظهرنا ان الكائنات الدقيقة المهندسة ، وبناء علي في المجرية التسليم ، يمكن ان تزيد من التحريض من الأمعاء الموجه الخلايا Treg في الانسجه اللمفاوية الطرفية6.
ميزه اضافيه من استراتيجيتنا المقترحة هي ان 1, 25 (OH)2D أيضا وظائف أخرى يمكن ان تستفيد من المرضي ibd. وتشمل هذه الوظائف الأخرى قدره 1, 25 (OH)2د لتحفيز إفراز ميكروبات22 ويقمع السرطان23. وكثيرا ما ترتبط العدوى والسرطان مع ibd24,25.
لتوليد DCs التي يمكن ان تنتج تركيزات عاليه محليا من كل من 1 ، 25 (OH)2D و RA دي نوفو ، ونحن نستخدم متجه لينتيفيرال لهندسه DCs للتعبير عن اثنين من الجينات. واحده مورثه ال [سيتوكروم] P450 أسره 27 [سوبف# اميلي] [ب] عضوه 1 (CYP27B1) ان رموز [25-هيدروكسي] [د] [1 α-هيدروكسيلاز] ([1 α-هيدروكسيلاز]), اي [فيسيولوجكلي] يحفز التوليف من 25 ([آه])2[د.]. الجين الآخر هو ديجينداز الدهيد 1 فرد الاسره A2 (ALDH1a2) ان الرموز الريتينالدهيد ديجينتاز 2 (RALDH2) ، الذي يحفز فسيولوجيا تخليق RA6.
لأنه في زيادة الجسم المجري من القناة الهضمية الحث Treg التعريفي الخلية من المحتمل ان تكون مهمة في علاج IBD ، في البروتوكول التالي سنقوم بالتفصيل الإجراءات لتوليد 1α-هيدروكسيلاز-RALDH2-overexpressing dc (DC-CYP-ALDH الخلايا) التي يمكن استخدامها للتحقيق في المستقبل من خلايا Treg القناة الهضمية في الجسم المجري.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه المقالة ونحن وصف استخدام الخلايا DC-CYP-ALDH ، لزيادة التحريض من الأمعاء الموجه الخلايا Treg في الانسجه اللمفاوية الطرفية. وقد أظهرت بياناتنا ان الخلايا DC-CYP-ALDH يمكن توليف تركيزات عاليه محليا من نوفو من كل من 1, 25 (OH)2D و RA في المختبر في وجود ركائز المقابلة (اي, 25 [OH] D و الريتينول, علي التوا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد حظي هذا العمل بدعم مكتب مساعد وزير الدفاع للشؤون الصحية من خلال برنامج البحوث الطبية الذي استعرضه النظراء في اطار الجائزة رقم W81XWH-15-1-0240 (XT). الآراء والتفسيرات والاستنتاجات والتوصيات هي تلك التي للمؤلف ولا تؤيدها بالضرورة وزاره الدفاع. وقد دعم هذا العمل أيضا جزئيا بمنح الابتكار البحثي من قسم الطب في جامعه لوما ليندا (681207-2967 [XT و GG] ، 681205-2967 [XT] ، و 325491 [DJB]).
Materials
| 10 mL syringes | ThermoFisher Scientific | Cat# 03-377-23 | |
| 100 mm x 20 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430167 | |
| 12-well culture plates | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-200-82 | |
| 150 mm x 25 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430559 | |
| 25-hydroxycholecalciferol (25[OH]D) | Sigma-Aldrich | Cat# H4014 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| 2-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | Cat#: 21985023 | |
| 6-well culture plates | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-200-83 | |
| ALDEFLUOR kit | Stemcell Technologies | Cat# 01700 | |
| Anti-CYP27B1 | Abcam | Cat# ab95047 | |
| BD FACSAria II | BD Biosciences | N/A | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# C1016 | |
| CM-10-D cell culture medium | DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
| CM-10-R cell culture medium | RPMI 1640 medium (no glutamine) containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
| CM-4-D cell culture medium | DMEM medium containing 4% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
| Corning bottle-top vacuum filters, 0.22 mM, 500 mL | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430513 | |
| Corning bottle-top vacuum filters, 0.45 mM, 500 mL | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430514 | |
| Dissecting scissor | ThermoFisher Scientific | Cat# 08-940 | |
| DMEM medium | ThermoFisher Scientific | Cat# 11960044 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | Cat# 16000044 | |
| Forceps | ThermoFisher Scientific | Cat# 22-327379 | |
| Gibco ACK lysing buffer | ThermoFisher Scientific | Cat# A1049201 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | Cat# G5516 | |
| Goat anti-rabbit IgG | Abcam | Cat# ab205718 | |
| HEPES | Millipore | Cat# 391340 | |
| Lenti-CYP-ALDH | Custom-made | 1.6-kb mouse CYP27B1 and ALDH1a2 cDNAs were amplified by PCR using a plasmid containing the CYP27B1 cDNA and a plasmid containing the ALDH1a2 cDNA respectively (GeneCopoeia). The amplified CYP27B1 cDNA fragment with a 5' KOZAK ribosome entry sequence was cloned into the pRRL-SIN.cPPt.PGKGFP.WPRE lentiviral vector (Addgene). The resulting construct was designated as lenti-CYP-GFP. The amplified ALDH1a2 cDNA fragment was cloned into the lenti-CYP-GFP to replace the GFP and was designated as lenti-CYP-ALDH. This bicistronic plasmid expresses CYP27B1 controlled by SFFV promoter and ALDH1a2 controlled by PGK promoter. | |
| L-glutamine | ThermoFisher Scientific | Cat#25030081 | |
| Lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | Cat# L3755 | |
| Murine GM-CSF | Peprotech | Cat# 315-03 | |
| Murine IL-4 | Peprotech | Cat# 214-14 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | Cat# NIST2186II | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | Cat# S9888 | |
| Needles | ThermoFisher Scientific | Cat# 14-841-02 | |
| Nonessential Amino Acids | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11140076 | |
| pCMVR8.74 | Addgene | Plasmid# 22036 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | Cat#15140148 | |
| Phoshate Balanced Solution (PBS) | ThermoFisher Scientific | Cat#: 20012027 | |
| PMD2G | Addgene | Plasmid# 12259 | |
| Polypropylene tube, 15 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# AM12500 | |
| Polypropylene tube, 50 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# AM12502 | |
| Protamine sulfate | Sigma-Aldrich | Cat# P3369 | |
| Rabbit polycloncal IgG isotype control | Abcam | Cat# ab171870 | |
| Radioimmunoassay for 1,25(OH)2D measurement | Heartland Assays | ||
| RPMI 1640 medium, no glutamine | ThermoFisher Scientific | Cat# 21870076 | |
| Sodium pyruvat | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11360070 | |
| Sorvall Legend XTR Centrifuge | ThermoFisher Scientific | Cat# 75004521 | |
| Sterile Cell strainers, 40 mm | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-201-430 | |
| Sterile storage bottles, 500 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# CLS431432 |
References
- Abraham, C., Cho, J. H. Inflammatory bowel disease. New England Journal of Medicine. 361 (21), 2066-2078 (2009).
- Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. Inflammatory bowel disease. Annual Reviews in Immunology. 28, 573-621 (2010).
- Clifford, D. B., et al. Natalizumab-associated progressive multifocal leukoencephalopathy in patients with multiple sclerosis: lessons from 28 cases. Lancet Neurology. 9 (4), 438-446 (2010).
- Linda, H., et al. Progressive multifocal leukoencephalopathy after natalizumab monotherapy. New England Journal of Medicine. 361 (11), 1081-1087 (2009).
- Fischer, A., et al. Differential effects of alpha4beta7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo. Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).
- Xu, Y., et al. In Vivo Generation of Gut-Homing Regulatory T Cells for the Suppression of Colitis. Journal of Immunology. 202 (12), 3447-3457 (2019).
- Rosenblum, M. D., Way, S. S., Abbas, A. K. Regulatory T cell memory. Nature Reviews Immunology. 16 (2), 90-101 (2016).
- Grimm, A. J., Kontos, S., Diaceri, G., Quaglia-Thermes, X., Hubbell, J. A. Memory of tolerance and induction of regulatory T cells by erythrocyte-targeted antigens. Science Report. 5, 15907 (2015).
- Kim, H. J., et al. Stable inhibitory activity of regulatory T cells requires the transcription factor Helios. Science. 350 (6258), 334-339 (2015).
- Bhela, S., et al. The Plasticity and Stability of Regulatory T Cells during Viral-Induced Inflammatory Lesions. Journal of Immunology. 199 (4), 1342-1352 (2017).
- Bluestone, J. A., et al. Type 1 diabetes immunotherapy using polyclonal regulatory T cells. Science Translational Medicine. 7 (315), (2015).
- Marek-Trzonkowska, N., et al. Therapy of type 1 diabetes with CD4(+)CD25(high)CD127-regulatory T cells prolongs survival of pancreatic islets – results of one year follow-up. Clinical Immunology. 153 (1), 23-30 (2014).
- Desreumaux, P., et al. Safety and efficacy of antigen-specific regulatory T-cell therapy for patients with refractory Crohn’s disease. Gastroenterology. 143 (5), 1201-1202 (2012).
- Di Ianni, M., et al. Tregs prevent GVHD and promote immune reconstitution in HLA-haploidentical transplantation. Blood. 117 (14), 3921-3928 (2011).
- Brunstein, C. G., et al. Infusion of ex vivo expanded T regulatory cells in adults transplanted with umbilical cord blood: safety profile and detection kinetics. Blood. 117 (3), 1061-1070 (2011).
- Kang, S. W., et al. 1,25-Dihyroxyvitamin D3 promotes FOXP3 expression via binding to vitamin D response elements in its conserved noncoding sequence region. Journal of Immunology. 188 (11), 5276-5282 (2012).
- Correale, J., Ysrraelit, M. C., Gaitan, M. I. Immunomodulatory effects of Vitamin D in multiple sclerosis. Brain. 132, 1146-1160 (2009).
- Iwata, M., et al. Retinoic acid imprints gut-homing specificity on T cells. Immunity. 21 (4), 527-538 (2004).
- Steinman, R. M., Banchereau, J. Taking dendritic cells into medicine. Nature. 449 (7161), 419-426 (2007).
- Vicente-Suarez, I., Brayer, J., Villagra, A., Cheng, F., Sotomayor, E. M. TLR5 ligation by flagellin converts tolerogenic dendritic cells into activating antigen-presenting cells that preferentially induce T-helper 1 responses. Immunology Letters. 125 (2), 114-118 (2009).
- Danova, K., et al. NF-kappaB, p38 MAPK, ERK1/2, mTOR, STAT3 and increased glycolysis regulate stability of paricalcitol/dexamethasone-generated tolerogenic dendritic cells in the inflammatory environment. Oncotarget. 6 (16), 14123-14138 (2015).
- Liu, P. T., et al. Toll-like receptor triggering of a vitamin D-mediated human antimicrobial response. Science. 311 (5768), 1770-1773 (2006).
- Cao, H., et al. Application of vitamin D and vitamin D analogs in acute myelogenous leukemia. Experimental Hematology. 50, 1-12 (2017).
- Anderson, A., et al. Lasting Impact of Clostridium difficile Infection in Inflammatory Bowel Disease: A Propensity Score Matched Analysis. Inflammatory Bowel Disease. 23 (12), 2180-2188 (2017).
- Tsai, J. H., et al. Association of Aneuploidy and Flat Dysplasia With Development of High-Grade Dysplasia or Colorectal Cancer in Patients With Inflammatory Bowel Disease. Gastroenterology. 153 (6), 1492-1495 (2017).
- Lee, H. W., et al. Tracking of dendritic cell migration into lymph nodes using molecular imaging with sodium iodide symporter and enhanced firefly luciferase genes. Science Reports. 5, 9865 (2015).
- Shen, Z., Reznikoff, G., Dranoff, G., Rock, K. L. Cloned dendritic cells can present exogenous antigens on both MHC class I and class II molecules. Journal of Immunology. 158 (6), 2723-2730 (1997).
- Okada, N., et al. Administration route-dependent vaccine efficiency of murine dendritic cells pulsed with antigens. British Journal of Cancer. 84 (11), 1564-1570 (2001).
- Li, C. H., et al. Dendritic cells, engineered to overexpress 25-hydroxyvitamin D 1alpha-hydroxylase and pulsed with a myelin antigen, provide myelin-specific suppression of ongoing experimental allergic encephalomyelitis. FASEB J. , (2017).
- Narula, N., et al. Impact of High-Dose Vitamin D3 Supplementation in Patients with Crohn’s Disease in Remission: A Pilot Randomized Double-Blind Controlled Study. Digestive Disease Science. 62 (2), 448-455 (2017).
- Ahmad, S. M., et al. Vitamin A Supplementation during Pregnancy Enhances Pandemic H1N1 Vaccine Response in Mothers, but Enhancement of Transplacental Antibody Transfer May Depend on When Mothers Are Vaccinated during Pregnancy. Journal of Nutrition. 148 (12), 1968-1975 (2018).
- Noronha, S. M. R., et al. Aldefluor protocol to sort keratinocytes stem cells from skin. Acta Cirurgica Brasileira. 32 (11), 984-994 (2017).
- Ferreira, G. B., et al. Vitamin D3 Induces Tolerance in Human Dendritic Cells by Activation of Intracellular Metabolic Pathways. Cell Reports. 10 (5), 711-725 (2015).
- Bakdash, G., Vogelpoel, L. T., van Capel, T. M., Kapsenberg, M. L., de Jong, E. C. Retinoic acid primes human dendritic cells to induce gut-homing, IL-10-producing regulatory T cells. Mucosal Immunology. 8 (2), 265-278 (2015).
