In Vivo Augmentazione dell'induzione delle cellule T regolatorie Gut-Homing
Summary
Qui presentiamo un protocollo per l’aumento in vivo dell’induzione delle cellule T regolatorie gut-homing. In questo protocollo, le cellule dendritiche sono progettate per produrre localmente alte concentrazioni della vitamina D attiva (1,25-dihydroxyvitamin D o 1,25[OH]2D) e la vitamina attiva A (acido retinoico o RA) de novo.
Abstract
La malattia infiammatoria intestinale (IBD) è una malattia cronica infiammatoria nel tratto gastrointestinale (GUT). Negli Stati Uniti, ci sono circa 1,4 milioni di pazienti con IBD. È generalmente accettato che una risposta immunitaria disregolata ai batteri intestinali avvia la malattia e interrompe la barriera epiteliale mucosale. Recentemente dimostriamo che le cellule T (Treg) regolatorie gut-homing sono una terapia promettente per l’IBD. Di conseguenza, questo articolo presenta un protocollo per l’aumento in vivo dell’induzione delle cellule Treg gut-homing. In questo protocollo, le cellule dendritiche sono progettate per produrre concentrazioni localmente elevate di due molecole de novo, vitamina D attiva (1,25-dihydroxyvitamin D o 1,25[OH]2D) e vitamina A attiva (acido retinoico o RA). Abbiamo scelto 1,25(OH)2D e RA sulla base di risultati precedenti che mostrano che 1,25(OH)2D possono indurre l’espressione di molecole regolatorie (ad esempio, box forcella P3 e interleucina-10) e che l’AR può stimolare l’espressione dei recettori gut-homing nelle cellule T. Per generare tali cellule dendritiche ingegnerizzate, utilizziamo un vettore lentivirale per traduciare le cellule dendritiche per sovraesprimere due geni. Un gene è il citocromo P450 famiglia 27 sottofamiglia B membro 1 che codifica 25-idrossivitamina D 1,idrossilasi, che catalizza fisiologicamente la sintesi di 1,25(OH)2D. L’altro gene è la dehydrogenasi di aldeide 1 membro della famiglia A2 che codifica la retinaldedeide dehydrogenasi 2, che catalizza fisiologicamente la sintesi dell’AR. Questo protocollo può essere utilizzato per future indagini sulle cellule Treg gut-homing in vivo.
Introduction
La malattia infiammatoria intestinale (IBD) è una malattia cronica infiammatoria nel tratto gastrointestinale (GUT). Negli Stati Uniti, ci sono circa 1,4 milioni di pazienti con IBD. È generalmente accettato che una risposta immunitaria disregolata ai batteri intestinali avvia la malattia e interrompe la barriera epitelialemucosale 1,2. Per questo motivo, attualmente disponibili farmaci approvati U.S. Food and Drug Administration (FDA) inibiscono le funzioni dei mediatori infiammatori o bloccano l’homing delle cellule immunitarie nell’intestino. Tuttavia, i mediatori infiammatori e le cellule immunitarie che sono mirati sono necessari anche per le difese immunitarie. Di conseguenza, gli inibitori del mediatore infiammatorio compromettono la difesa immunitaria sistemica e i bloccanti dell’homing delle cellule immunitarie indeboliscono la difesa immunitaria intestinale, entrambe le quali possono portare a gravi conseguenze3,4. Inoltre, gli bloccanti delle cellule immunitarie possono anche bloccare l’homing delle cellule T (Treg) regolatorie nell’intestino e quindi possono peggiorare la tolleranza immunitaria intestinale già compromessa nei pazienti affetti da IBD. Inoltre, il blocco delle cellule di Treg homing nell’intestino può anche portare alla soppressione immunitaria sistemica a causa dell’accumulo di cellule Treg nel sangue5. Infine, gli inibitori e i bloccanti funzionano in modo transitorio e, di conseguenza, richiedono amministrazioni frequenti. La frequente somministrazione di questi inibitori e bloccanti può esacerbare ulteriormente gli effetti collaterali spiacevoli.
Recentemente, abbiamo proposto una nuova strategia che può potenzialmente mitigare o addirittura eliminare gli effetti collaterali associati ai farmaci attuali per il trattamento Con IBD6. Questa strategia aumenta l’induzione delle cellule Treg gut-homing nei tessuti linfoidi periferici6. La logica di questa strategia è che le cellule Treg gut-homing specificamente casa per l’intestino e quindi non compromettere le difese immunitarie sistemiche. Inoltre, poiché le cellule Treg possono potenzialmente formare memoria7,8, cellule Treg gut-homing possono potenzialmente fornire un controllo stabile dell’infiammazione cronica dell’intestino nei pazienti Con IBD e, quindi, il trattamento non dovrebbe essere somministrato con la stessa frequenza. Inoltre, poiché questa strategia aumenta l’induzione delle cellule Treg gut-homing in vivo, non ha la preoccupazione di instabilità in vivo in un ambiente altamente proinfiammatorio che è associato con il trasferimento adottivo di cellule Treg generate in vitro9,10. A questo proposito, le cellule Treg generate in vitro sono una delle strategie proposte per il trattamento delle malattie autoimmuni11,12,13 e rigetto del trapianto14,15. Infine, in questa strategia, le cellule dendritiche (DC) sono progettate per produrre concentrazioni localmente elevate di due molecole de novo: vitamina D attiva (1,25-dihydroxyvitamin D o 1,25[OH]2D) e vitamina A attiva (acido retinoico o RA). Abbiamo scelto 1,25(OH)2D e RA perché 1,25(OH)2D possono indurre l’espressione di molecole regolatorie (ad esempio, forchetta box P3 [foxp3] e interleutra-10 [IL-10])16,17 e che l’AR può stimolare l’espressione dei recettori gut-homing nelle cellule T18. Poiché sia 1,25(OH)2D che RA possono anche tollerare i controller di dominio28,29, ragioniamo che i controller di dominio ingegnerizzati saranno mantenuti stabilmente in uno stato tolerogenico in vivo e quindi eludere le preoccupazioni inpresentisti che sono associate con DC tolerogeni generati in vitro (TolDC)19,20,21. A questo proposito, i TolDC sono anche una delle strategie proposte per l’aumento in vivo delle funzioni cellulari Treg19,20,21. Per sostenere il nostro ragionamento, abbiamo dimostrato che i CONTROLLER di dominio ingegnerizzati, al momento della consegna in vivo, possono aumentare l’induzione delle cellule Treg gut-homing nei tessuti linfoidi periferici6.
Un ulteriore vantaggio della nostra strategia proposta è che 1,25(OH)2D ha anche altre funzioni che possono potenzialmente beneficiare i pazienti con IBD. Queste altre funzioni includono la capacità di 1,25(OH)2D per stimolare la secrezione di antimicrobici22 e per sopprimere la carcinogenesi23. Infezioni e tumori sono spesso associati con IBD24,25.
Per generare i CONTROLLER di dominio in grado di produrre concentrazioni locali elevate sia di 1,25(OH)2D che di RA de novo, utilizziamo un vettore lentivirale per progettare dc per sovraesprimere due geni. Un gene è il citocromo P450 famiglia 27 sottofamiglia B membro 1 (CYP27B1) che codifica 25-idrossivitamina D 1-idrossilasi (1-idrossislasi), che catalizza fisiologicamente la sintesi di 1,25(OH)2D. L’altro gene è l’aldeide dehydrogenasi 1 membro della famiglia A2 (ALDH1a2) che codifica retinaldeide dehydrogenasi 2 (RALDH2), che catalizza fisiologicamente la sintesi di RA6.
Poiché l’aumento in vivo dell’induzione delle cellule Treg gut-homing è potenzialmente importante nel trattamento dell’IBD, nel seguente protocollo ildettagliamo le procedure per la generazione dei DC inesprimibili 1-idrossilasi-RALDH2 (cellule DC-CYP-ALDH) che può essere utilizzato per la futura indagine sulle cellule Treg gut-homing in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo articolo viene descritto l’uso di cellule DC-CYP-ALDH, per aumentare l’induzione delle cellule Treg gut-homing nei tessuti linfoidi periferici. I nostri dati hanno dimostrato che le cellule DC-CYP-ALDH possono sintetizzare localmente alte concentrazioni de novo sia di 1,25 (OH)2D e RA in vitro in presenza di substrati corrispondenti (cioè, 25[OH]D e retinolo, rispettivamente). Poiché sufficienti concentrazioni ematiche di 25(OH)D e retinolo possono essere facilmente raggiunte attraverso i supplemen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dall’Ufficio dell’Assistente Segretario della Difesa per gli Affari Sanitari attraverso il Peer Reviewed Medical Research Program sotto il premio N. . W81XWH-15-1-0240 (XT). Opinioni, interpretazioni, conclusioni e raccomandazioni sono quelli dell’autore e non sono necessariamente approvati dal Dipartimento della Difesa. Questo lavoro è stato anche parzialmente sostenuto da Research Innovation Grants del Dipartimento di Medicina dell’Università di Loma Linda (681207-2967 [XT e GG], 681205-2967 [XT] e 325491 [DJB]).
Materials
| 10 mL syringes | ThermoFisher Scientific | Cat# 03-377-23 | |
| 100 mm x 20 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430167 | |
| 12-well culture plates | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-200-82 | |
| 150 mm x 25 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430559 | |
| 25-hydroxycholecalciferol (25[OH]D) | Sigma-Aldrich | Cat# H4014 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| 2-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | Cat#: 21985023 | |
| 6-well culture plates | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-200-83 | |
| ALDEFLUOR kit | Stemcell Technologies | Cat# 01700 | |
| Anti-CYP27B1 | Abcam | Cat# ab95047 | |
| BD FACSAria II | BD Biosciences | N/A | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# C1016 | |
| CM-10-D cell culture medium | DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
| CM-10-R cell culture medium | RPMI 1640 medium (no glutamine) containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
| CM-4-D cell culture medium | DMEM medium containing 4% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
| Corning bottle-top vacuum filters, 0.22 mM, 500 mL | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430513 | |
| Corning bottle-top vacuum filters, 0.45 mM, 500 mL | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430514 | |
| Dissecting scissor | ThermoFisher Scientific | Cat# 08-940 | |
| DMEM medium | ThermoFisher Scientific | Cat# 11960044 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | Cat# 16000044 | |
| Forceps | ThermoFisher Scientific | Cat# 22-327379 | |
| Gibco ACK lysing buffer | ThermoFisher Scientific | Cat# A1049201 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | Cat# G5516 | |
| Goat anti-rabbit IgG | Abcam | Cat# ab205718 | |
| HEPES | Millipore | Cat# 391340 | |
| Lenti-CYP-ALDH | Custom-made | 1.6-kb mouse CYP27B1 and ALDH1a2 cDNAs were amplified by PCR using a plasmid containing the CYP27B1 cDNA and a plasmid containing the ALDH1a2 cDNA respectively (GeneCopoeia). The amplified CYP27B1 cDNA fragment with a 5' KOZAK ribosome entry sequence was cloned into the pRRL-SIN.cPPt.PGKGFP.WPRE lentiviral vector (Addgene). The resulting construct was designated as lenti-CYP-GFP. The amplified ALDH1a2 cDNA fragment was cloned into the lenti-CYP-GFP to replace the GFP and was designated as lenti-CYP-ALDH. This bicistronic plasmid expresses CYP27B1 controlled by SFFV promoter and ALDH1a2 controlled by PGK promoter. | |
| L-glutamine | ThermoFisher Scientific | Cat#25030081 | |
| Lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | Cat# L3755 | |
| Murine GM-CSF | Peprotech | Cat# 315-03 | |
| Murine IL-4 | Peprotech | Cat# 214-14 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | Cat# NIST2186II | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | Cat# S9888 | |
| Needles | ThermoFisher Scientific | Cat# 14-841-02 | |
| Nonessential Amino Acids | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11140076 | |
| pCMVR8.74 | Addgene | Plasmid# 22036 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | Cat#15140148 | |
| Phoshate Balanced Solution (PBS) | ThermoFisher Scientific | Cat#: 20012027 | |
| PMD2G | Addgene | Plasmid# 12259 | |
| Polypropylene tube, 15 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# AM12500 | |
| Polypropylene tube, 50 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# AM12502 | |
| Protamine sulfate | Sigma-Aldrich | Cat# P3369 | |
| Rabbit polycloncal IgG isotype control | Abcam | Cat# ab171870 | |
| Radioimmunoassay for 1,25(OH)2D measurement | Heartland Assays | ||
| RPMI 1640 medium, no glutamine | ThermoFisher Scientific | Cat# 21870076 | |
| Sodium pyruvat | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11360070 | |
| Sorvall Legend XTR Centrifuge | ThermoFisher Scientific | Cat# 75004521 | |
| Sterile Cell strainers, 40 mm | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-201-430 | |
| Sterile storage bottles, 500 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# CLS431432 |
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