Bağırsak-Homing Düzenleyici T Hücre İndüksiyon In Vivo Augmentation
Summary
Burada bağırsak-homing düzenleyici T hücre indüksiyon invivo büyütme için bir protokol sıyoruz. Bu protokolde, dendritik hücreler lokal olarak aktif D vitamini (1,25-dihidroksivitamin D veya 1,25[OH]2D) ve aktif A vitamini (retinoik asit veya RA) de novo yüksek konsantrasyonlarda üretmek için tasarlanır.
Abstract
İnflamatuar barsak hastalığı (IBD) gastrointestinal sistemde (GUT) inflamatuar kronik bir hastalıktır. Amerika Birleşik Devletleri’nde yaklaşık 1.4 milyon IBD hastası bulunmaktadır. Genellikle bağırsak bakterileri için bir disregulated bağışıklık yanıtı hastalığı başlatır ve mukozal epitel bariyeri bozar kabul edilir. Biz son zamanlarda gut-homing düzenleyici T (Treg) hücreleri IBD için umut verici bir tedavi olduğunu göstermektedir. Buna göre, bu makalede gut-homing Treg hücre indüksiyon in vivo büyütme için bir protokol sunar. Bu protokolde, dendritik hücreler iki molekül de novo, aktif D vitamini (1,25-dihidroksyvitamin D veya 1,25[OH]2D) ve aktif A vitamini (retinoik asit veya RA) yerel olarak yüksek konsantrasyonlarda üretmek için tasarlanır. 1,25(OH)2D ve RA’yı, 1,25(OH)2D’nin düzenleyici moleküllerin ekspresyonunu (örneğin, çatal kafa kutusu P3 ve interlökin-10) ve RA’nın T hücrelerindeki bağırsak-homing reseptörlerinin ekspresyonunu uyarabileceğini gösteren önceki bulgulara dayanarak seçtik. Bu tür mühendislik dendritik hücreleri oluşturmak için, dendritik hücreleri iki geni aşırı eksprese etmek için vermek için lentiviral vektör kullanıyoruz. Genlerden biri, fizyolojik olarak 1,25(OH) 2 D sentezini katalize eden 25-hidroksivitamin D 1α-hidroksilaz kodlayan sitokrom P450 familyası27alt familya 1’dir. Diğer gen aldehit dehidrogenaz 1 aile üyesi A2 retinaldehit dehidrogenaz kodlar 2, fizyolojik RA sentezini katalizler. Bu protokol in vivo bağırsak-homing Treg hücrelerinin gelecekteki araştırma için kullanılabilir.
Introduction
İnflamatuar barsak hastalığı (IBD) gastrointestinal sistemde (GUT) inflamatuar kronik bir hastalıktır. Amerika Birleşik Devletleri’nde yaklaşık 1.4 milyon IBD hastası bulunmaktadır. Genellikle bağırsak bakterileri için bir disregulated bağışıklık yanıtı hastalığı başlatır ve mukozal epitel bariyer bozan kabul edilir1,2. Bu nedenle, şu anda mevcut ABD Gıda ve İlaç İdaresi (FDA) onaylı ilaçlar inflamatuar mediatörlerin işlevlerini inhibe veya bağırsak içine bağışıklık hücrelerinin homing engellemek. Ancak, inflamatuar mediatörler ve hedeflenen bağışıklık hücreleri de bağışıklık savunması için gereklidir. Sonuç olarak, inflamatuar arabulucu inhibitörleri sistemik bağışıklık savunma ve bağışıklık hücresi homing blokerler bağışıklık bağışıklık savunma zayıflatmak, her ikisi de ciddi sonuçlara yol açabilir3,4. Buna ek olarak, bağışıklık hücresi homing blokerler de bağırsak içine düzenleyici T homing engelleyebilir (Treg) hücreleri ve dolayısıyla IBD hastalarında zaten tehlikeye bağırsak bağışıklık toleransı kötüleştirebilir. Ayrıca, bağırsak içine Treg hücre homing engelleme de kanda Treg hücrelerinin birikimi nedeniyle sistemik bağışıklık baskılanmasına yol açabilir5. Son olarak, inhibitörler ve blokerler geçici olarak çalışır ve bu nedenle sık sık yönetimgerektirir. Bu inhibitörlerve blokerlerin sık uygulanması daha da istenmeyen yan etkileri şiddetlendirebilir.
Son zamanlarda, potansiyel olarak hafifletmek ve hatta IBD tedavisi için mevcut ilaçlar ile ilişkili yan etkileri ortadan kaldırmak yeni bir strateji önerdi6. Bu strateji periferik lenfoid dokularda gut-homing Treg hücrelerinin indüksiyon artar6. Bu stratejinin mantığı gut-homing Treg hücreleri özellikle bağırsak ev ve dolayısıyla sistemik bağışıklık savunma ödün olmayacaktır. Buna ek olarak, Treg hücreleri potansiyel bellek oluşturabilir beri7,8, bağırsak-homing Treg hücreleri potansiyel IBD hastalarında kronik bağırsak iltihabı istikrarlı bir kontrol sağlayabilir ve, bu nedenle, tedavi sık sık uygulanması gerekmez. Ayrıca, bu strateji in vivo bağırsak-homing Treg hücrelerinin indüksiyon artırır bu yana, in vitro oluşturulan Treg hücrelerinin benimseyen transferi ile ilişkili son derece proinflamatuar bir ortamda in vivo instabilite endişe yok9,10. Bu bağlamda, in vitro oluşturulan Treg hücreleri otoimmün hastalıkların tedavisi için önerilen stratejilerden biridir11,12,13 ve nakil reddi14,15. Son olarak, bu stratejide, dendritik hücreler (DCs) iki molekül de novo yerel olarak yüksek konsantrasyonlarda üretmek için tasarlanmış: aktif D vitamini (1,25-dihidroksyvitamin D veya 1,25[OH]2D) ve aktif A vitamini (retinoik asit veya RA). Biz 1,25 (OH)2D ve RA seçti, çünkü 1,25(OH)2D düzenleyici moleküllerin ekspresyonunu neden olabilir (örneğin, forkhead kutusu P3 [foxp3] ve interlökin-10 [IL-10])16,17 ve RA T hücrelerinde bağırsak-homing reseptörlerinin ekspresyonunu uyarabilir18. Her iki 1.25 (OH)2D ve RA da DCs28,29tolere çünkü, biz mühendislik DC’ler stably vivo bir tolerojenik statüde muhafaza edilecek ve dolayısıyla in vitro tolerojenik DCs (TolDCs)19,20,21oluşturulan in vivo invivo instabilite endişeleri atlatmak neden . Bu bağlamda, TolDCs da Treg hücre fonksiyonları19,20,21in vivo büyütme için önerilen stratejilerden biridir. Bizim akıl desteklemek için, biz mühendislik DC’ler, in vivo teslim üzerine, periferik lenfoid dokularda gut-homing Treg hücrelerinin indüksiyon artırabilirsiniz göstermiştir6.
Önerilen stratejimizin bir diğer avantajı da 1,25(OH)2D’nin IBD hastalarına fayda sağleyebilecek başka işlevlere sahip olmasıdır. Bu diğer fonksiyonlar antimikrobiyallerin salgılanmasını uyarmak için 1,25 (OH)2D yeteneği içerir22 ve karsinogenez bastırmak için23. Enfeksiyonlar ve kanserler sık lıkla IBD24,25ile ilişkilidir.
1,25(OH)2D ve RA de novo yerel olarak yüksek konsantrasyonlarda üretebilir DC’ler oluşturmak için, iki gen aşırı ifade etmek için DC’ler mühendislik için bir lentiviral vektör kullanın. Genlerden biri, fizyolojik olarak 1,25(OH) 2 D sentezini katalize eden 25-hidroksivitamin D 1α-hidroksilaz (1α-hidroksilaz) kodlayan sitokrom P450 familyası27alt familya B üyesi 1 (CYP27B1) dir. Diğer gen aldehit dehidrogenaz 1 aile üyesi A2 (ALDH1a2) retinaldehit dehidrogenaz kodlar 2 (RALDH2), fizyolojik RAsentezinikatalizler 6 .
Gut-homing Treg hücre indüksiyonunun in vivo arttırılması IBD tedavisinde potansiyel olarak önemli olduğundan, aşağıdaki protokolde 1α-hidroksilaz-RALDH2-aşırı ifade edici DC’lerin (DC-CYP-ALDH hücreleri) üretimi için prosedürleri ayrıntılı olarak açıklayacaktır. in vivo bağırsak-homing Treg hücrelerinin gelecekteki araştırma için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makalede, dc-CYP-ALDH hücrelerinin kullanımı açıklanır, periferik lenfoid dokularda gut-homing Treg hücrelerinin indüksiyon artırmak için. Verilerimiz DC-CYP-ALDH hücrelerinin sırasıyla 1,25(OH)2D ve RA in vitro yerel olarak yüksek konsantrasyonlarda sentezleyebildiği gösterilmiştir (sırasıyla 25[OH]D ve retinol). 25(OH)D ve retinol yeterli kan konsantrasyonları kolayca eksikliği olan hastalarda sırasıyla D vitamini ve A takviyesi ile elde edilebilir çünkü30…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Sağlık İşleri Savunma Bakan Yardımcısı Ofisi tarafından Ödül No altında Peer Reviewed Tıbbi Araştırma Programı ile desteklenmiştir. W81XWH-15-1-0240 (XT). Görüşler, yorumlar, sonuçlar ve öneriler yazarın görüşleridir ve Savunma Bakanlığı tarafından mutlaka onaylanmaz. Bu çalışma aynı zamanda Kısmen Loma Linda Üniversitesi Tıp Bölümü (681207-2967 [XT ve GG], 681205-2967 [XT] ve 325491 [DJB] Araştırma Yenilik Hibetarafından desteklenmiştir.
Materials
| 10 mL syringes | ThermoFisher Scientific | Cat# 03-377-23 | |
| 100 mm x 20 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430167 | |
| 12-well culture plates | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-200-82 | |
| 150 mm x 25 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430559 | |
| 25-hydroxycholecalciferol (25[OH]D) | Sigma-Aldrich | Cat# H4014 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| 2-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | Cat#: 21985023 | |
| 6-well culture plates | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-200-83 | |
| ALDEFLUOR kit | Stemcell Technologies | Cat# 01700 | |
| Anti-CYP27B1 | Abcam | Cat# ab95047 | |
| BD FACSAria II | BD Biosciences | N/A | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# C1016 | |
| CM-10-D cell culture medium | DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
| CM-10-R cell culture medium | RPMI 1640 medium (no glutamine) containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
| CM-4-D cell culture medium | DMEM medium containing 4% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
| Corning bottle-top vacuum filters, 0.22 mM, 500 mL | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430513 | |
| Corning bottle-top vacuum filters, 0.45 mM, 500 mL | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430514 | |
| Dissecting scissor | ThermoFisher Scientific | Cat# 08-940 | |
| DMEM medium | ThermoFisher Scientific | Cat# 11960044 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | Cat# 16000044 | |
| Forceps | ThermoFisher Scientific | Cat# 22-327379 | |
| Gibco ACK lysing buffer | ThermoFisher Scientific | Cat# A1049201 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | Cat# G5516 | |
| Goat anti-rabbit IgG | Abcam | Cat# ab205718 | |
| HEPES | Millipore | Cat# 391340 | |
| Lenti-CYP-ALDH | Custom-made | 1.6-kb mouse CYP27B1 and ALDH1a2 cDNAs were amplified by PCR using a plasmid containing the CYP27B1 cDNA and a plasmid containing the ALDH1a2 cDNA respectively (GeneCopoeia). The amplified CYP27B1 cDNA fragment with a 5' KOZAK ribosome entry sequence was cloned into the pRRL-SIN.cPPt.PGKGFP.WPRE lentiviral vector (Addgene). The resulting construct was designated as lenti-CYP-GFP. The amplified ALDH1a2 cDNA fragment was cloned into the lenti-CYP-GFP to replace the GFP and was designated as lenti-CYP-ALDH. This bicistronic plasmid expresses CYP27B1 controlled by SFFV promoter and ALDH1a2 controlled by PGK promoter. | |
| L-glutamine | ThermoFisher Scientific | Cat#25030081 | |
| Lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | Cat# L3755 | |
| Murine GM-CSF | Peprotech | Cat# 315-03 | |
| Murine IL-4 | Peprotech | Cat# 214-14 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | Cat# NIST2186II | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | Cat# S9888 | |
| Needles | ThermoFisher Scientific | Cat# 14-841-02 | |
| Nonessential Amino Acids | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11140076 | |
| pCMVR8.74 | Addgene | Plasmid# 22036 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | Cat#15140148 | |
| Phoshate Balanced Solution (PBS) | ThermoFisher Scientific | Cat#: 20012027 | |
| PMD2G | Addgene | Plasmid# 12259 | |
| Polypropylene tube, 15 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# AM12500 | |
| Polypropylene tube, 50 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# AM12502 | |
| Protamine sulfate | Sigma-Aldrich | Cat# P3369 | |
| Rabbit polycloncal IgG isotype control | Abcam | Cat# ab171870 | |
| Radioimmunoassay for 1,25(OH)2D measurement | Heartland Assays | ||
| RPMI 1640 medium, no glutamine | ThermoFisher Scientific | Cat# 21870076 | |
| Sodium pyruvat | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11360070 | |
| Sorvall Legend XTR Centrifuge | ThermoFisher Scientific | Cat# 75004521 | |
| Sterile Cell strainers, 40 mm | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-201-430 | |
| Sterile storage bottles, 500 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# CLS431432 |
References
- Abraham, C., Cho, J. H. Inflammatory bowel disease. New England Journal of Medicine. 361 (21), 2066-2078 (2009).
- Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. Inflammatory bowel disease. Annual Reviews in Immunology. 28, 573-621 (2010).
- Clifford, D. B., et al. Natalizumab-associated progressive multifocal leukoencephalopathy in patients with multiple sclerosis: lessons from 28 cases. Lancet Neurology. 9 (4), 438-446 (2010).
- Linda, H., et al. Progressive multifocal leukoencephalopathy after natalizumab monotherapy. New England Journal of Medicine. 361 (11), 1081-1087 (2009).
- Fischer, A., et al. Differential effects of alpha4beta7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo. Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).
- Xu, Y., et al. In Vivo Generation of Gut-Homing Regulatory T Cells for the Suppression of Colitis. Journal of Immunology. 202 (12), 3447-3457 (2019).
- Rosenblum, M. D., Way, S. S., Abbas, A. K. Regulatory T cell memory. Nature Reviews Immunology. 16 (2), 90-101 (2016).
- Grimm, A. J., Kontos, S., Diaceri, G., Quaglia-Thermes, X., Hubbell, J. A. Memory of tolerance and induction of regulatory T cells by erythrocyte-targeted antigens. Science Report. 5, 15907 (2015).
- Kim, H. J., et al. Stable inhibitory activity of regulatory T cells requires the transcription factor Helios. Science. 350 (6258), 334-339 (2015).
- Bhela, S., et al. The Plasticity and Stability of Regulatory T Cells during Viral-Induced Inflammatory Lesions. Journal of Immunology. 199 (4), 1342-1352 (2017).
- Bluestone, J. A., et al. Type 1 diabetes immunotherapy using polyclonal regulatory T cells. Science Translational Medicine. 7 (315), (2015).
- Marek-Trzonkowska, N., et al. Therapy of type 1 diabetes with CD4(+)CD25(high)CD127-regulatory T cells prolongs survival of pancreatic islets – results of one year follow-up. Clinical Immunology. 153 (1), 23-30 (2014).
- Desreumaux, P., et al. Safety and efficacy of antigen-specific regulatory T-cell therapy for patients with refractory Crohn’s disease. Gastroenterology. 143 (5), 1201-1202 (2012).
- Di Ianni, M., et al. Tregs prevent GVHD and promote immune reconstitution in HLA-haploidentical transplantation. Blood. 117 (14), 3921-3928 (2011).
- Brunstein, C. G., et al. Infusion of ex vivo expanded T regulatory cells in adults transplanted with umbilical cord blood: safety profile and detection kinetics. Blood. 117 (3), 1061-1070 (2011).
- Kang, S. W., et al. 1,25-Dihyroxyvitamin D3 promotes FOXP3 expression via binding to vitamin D response elements in its conserved noncoding sequence region. Journal of Immunology. 188 (11), 5276-5282 (2012).
- Correale, J., Ysrraelit, M. C., Gaitan, M. I. Immunomodulatory effects of Vitamin D in multiple sclerosis. Brain. 132, 1146-1160 (2009).
- Iwata, M., et al. Retinoic acid imprints gut-homing specificity on T cells. Immunity. 21 (4), 527-538 (2004).
- Steinman, R. M., Banchereau, J. Taking dendritic cells into medicine. Nature. 449 (7161), 419-426 (2007).
- Vicente-Suarez, I., Brayer, J., Villagra, A., Cheng, F., Sotomayor, E. M. TLR5 ligation by flagellin converts tolerogenic dendritic cells into activating antigen-presenting cells that preferentially induce T-helper 1 responses. Immunology Letters. 125 (2), 114-118 (2009).
- Danova, K., et al. NF-kappaB, p38 MAPK, ERK1/2, mTOR, STAT3 and increased glycolysis regulate stability of paricalcitol/dexamethasone-generated tolerogenic dendritic cells in the inflammatory environment. Oncotarget. 6 (16), 14123-14138 (2015).
- Liu, P. T., et al. Toll-like receptor triggering of a vitamin D-mediated human antimicrobial response. Science. 311 (5768), 1770-1773 (2006).
- Cao, H., et al. Application of vitamin D and vitamin D analogs in acute myelogenous leukemia. Experimental Hematology. 50, 1-12 (2017).
- Anderson, A., et al. Lasting Impact of Clostridium difficile Infection in Inflammatory Bowel Disease: A Propensity Score Matched Analysis. Inflammatory Bowel Disease. 23 (12), 2180-2188 (2017).
- Tsai, J. H., et al. Association of Aneuploidy and Flat Dysplasia With Development of High-Grade Dysplasia or Colorectal Cancer in Patients With Inflammatory Bowel Disease. Gastroenterology. 153 (6), 1492-1495 (2017).
- Lee, H. W., et al. Tracking of dendritic cell migration into lymph nodes using molecular imaging with sodium iodide symporter and enhanced firefly luciferase genes. Science Reports. 5, 9865 (2015).
- Shen, Z., Reznikoff, G., Dranoff, G., Rock, K. L. Cloned dendritic cells can present exogenous antigens on both MHC class I and class II molecules. Journal of Immunology. 158 (6), 2723-2730 (1997).
- Okada, N., et al. Administration route-dependent vaccine efficiency of murine dendritic cells pulsed with antigens. British Journal of Cancer. 84 (11), 1564-1570 (2001).
- Li, C. H., et al. Dendritic cells, engineered to overexpress 25-hydroxyvitamin D 1alpha-hydroxylase and pulsed with a myelin antigen, provide myelin-specific suppression of ongoing experimental allergic encephalomyelitis. FASEB J. , (2017).
- Narula, N., et al. Impact of High-Dose Vitamin D3 Supplementation in Patients with Crohn’s Disease in Remission: A Pilot Randomized Double-Blind Controlled Study. Digestive Disease Science. 62 (2), 448-455 (2017).
- Ahmad, S. M., et al. Vitamin A Supplementation during Pregnancy Enhances Pandemic H1N1 Vaccine Response in Mothers, but Enhancement of Transplacental Antibody Transfer May Depend on When Mothers Are Vaccinated during Pregnancy. Journal of Nutrition. 148 (12), 1968-1975 (2018).
- Noronha, S. M. R., et al. Aldefluor protocol to sort keratinocytes stem cells from skin. Acta Cirurgica Brasileira. 32 (11), 984-994 (2017).
- Ferreira, G. B., et al. Vitamin D3 Induces Tolerance in Human Dendritic Cells by Activation of Intracellular Metabolic Pathways. Cell Reports. 10 (5), 711-725 (2015).
- Bakdash, G., Vogelpoel, L. T., van Capel, T. M., Kapsenberg, M. L., de Jong, E. C. Retinoic acid primes human dendritic cells to induce gut-homing, IL-10-producing regulatory T cells. Mucosal Immunology. 8 (2), 265-278 (2015).
