In Vivo Augmentation of Gut-Homing Regulatory T Cell Induction
Summary
Ici nous présentons un protocole pour l’augmentation in vivo de l’induction réglementaire de cellule T d’intestin-homing. Dans ce protocole, les cellules dendritiques sont conçues pour produire localement des concentrations élevées de la vitamine Active D (1,25-dihydroxyvitamin D ou 1,25[OH]2D) et de la vitamine A active (acide rétinoïque ou RA) de novo.
Abstract
La maladie intestinale inflammatoire (MII) est une maladie chronique inflammatoire dans le tractus gastro-intestinal (GUT). Aux États-Unis, il y a environ 1,4 million de patients atteints de MII. Il est généralement admis qu’une réponse immunitaire dysrégulée aux bactéries intestinales déclenche la maladie et perturbe la barrière épithéliale muqueuse. Nous avons récemment montré que les cellules T (Treg) réglementaires gut-homing sont une thérapie prometteuse pour IBD. En conséquence, cet article présente un protocole pour l’augmentation in vivo de l’induction de cellules de Treg gut-homing. Dans ce protocole, les cellules dendritiques sont conçues pour produire localement des concentrations élevées de deux molécules de novo, la vitamine Active D (1,25-dihydroxyvitamin D ou 1,25[OH]2D) et la vitamine A active (acide rétinoïque ou RA). Nous avons choisi 1,25 (OH)2D et RA basé sur des résultats précédents montrant que 1,25 (OH)2D peut induire l’expression de molécules régulatrices (par exemple, boîte de tête de fourchette P3 et interleukine-10) et que la RA peut stimuler l’expression des récepteurs gut-homing dans les cellules T. Pour générer de telles cellules dendritiques machinées, nous utilisons un vecteur lentiviral pour transduire les cellules dendritiques pour surexprimer deux gènes. Un gène est la famille cytochrome P450 27 membre de la sous-famille B 1 qui code 25-hydroxyvitamine D 1-hydroxylase, qui catalyse physiologiquement la synthèse de 1,25 (OH)2D. L’autre gène est le déshydrogénase aldéhyde 1 membre de la famille A2 qui code la déshydrogénase rétinienne 2, qui catalyse physiologiquement la synthèse de la PR. Ce protocole peut être utilisé pour l’étude future des cellules de Treg gut-homing in vivo.
Introduction
La maladie intestinale inflammatoire (MII) est une maladie chronique inflammatoire dans le tractus gastro-intestinal (GUT). Aux États-Unis, il y a environ 1,4 million de patients atteints de MII. Il est généralement admis qu’une réponse immunitaire dysrégulée aux bactéries intestinales déclenche la maladie et perturbe la barrière épithéliale muqueuse1,2. Pour cette raison, actuellement disponibles U.S. Food and Drug Administration (FDA) médicaments approuvés inhibent les fonctions des médiateurs inflammatoires ou de bloquer le homing des cellules immunitaires dans l’intestin. Cependant, les médiateurs inflammatoires et les cellules immunitaires qui sont ciblées sont également nécessaires pour les défenses immunitaires. En conséquence, les inhibiteurs inflammatoires de médiateur compromettent la défense immunitaire systémique et les bloqueurs de homing de cellules immunitaires affaiblissent la défense immunisée d’intestin, qui peuvent mener aux conséquences graves3,4. En outre, les bloqueurs de homing de cellules immunitaires peuvent également bloquer le homing des cellules t (Treg) réglementaires dans l’intestin et ainsi peuvent aggraver la tolérance immunitaire d’intestin déjà compromise dans les patients d’IBD. En outre, le blocage de la cellule Treg homing dans l’intestin peut également conduire à la suppression immunitaire systémique en raison de l’accumulation de cellules Treg dans le sang5. Enfin, les inhibiteurs et les bloqueurs fonctionnent de façon transitoire et, par conséquent, nécessitent des administrations fréquentes. L’administration fréquente de ces inhibiteurs et bloqueurs peut exacerber davantage les effets secondaires fâcheux.
Récemment, nous avons proposé une nouvelle stratégie qui peut potentiellement atténuer ou même éliminer les effets secondaires associés aux médicaments actuels pour le traitement des MII6. Cette stratégie augmente l’induction des cellules Treg intestinales dans les tissus lymphoïdes périphériques6. La raison d’être de cette stratégie est que les cellules Treg gut-homing spécifiquement à la maison à l’intestin et donc ne compromettra pas les défenses immunitaires systémiques. En outre, puisque les cellules de Treg peuvent potentiellement former la mémoire7,8, cellules de Treg gut-homing peuvent potentiellement fournir un contrôle stable de l’inflammation chronique d’intestin dans les patients d’IBD et, ainsi, le traitement ne devrait pas devoir être administré aussi fréquemment. En outre, puisque cette stratégie augmente l’induction de cellules Treg gut-homing in vivo, il n’a pas le souci de l’instabilité in vivo dans un environnement hautement proinflammatoire qui est associé au transfert adoptif des cellules Treg générées in vitro9,10. À cet égard, les cellules Treg générées in vitro sont l’une des stratégies proposées pour le traitement des maladies auto-immunes11,12,13 et le rejet de transplantation14,15. Enfin, dans cette stratégie, les cellules dendritiques (DC) sont conçues pour produire localement des concentrations élevées de deux molécules de novo : la vitamine D active (1,25-dihydroxyvitamin D ou 1,25[OH]2D) et la vitamine A active (acide rétinoïque ou RA). Nous avons choisi 1,25(OH)2D et RA parce que 1,25 (OH)2D peut induire l’expression de molécules régulatrices (p. ex., boîte à fourche P3 [foxp3] et interleukine-10 [IL-10])16,17 et que la RA peut stimuler l’expression des récepteurs gut-homing dans les lymphocytes T18. Parce que les deux 1,25(OH)2D et RA peut également tolériser DCs28,29, nous raison non plus que les DC machinés seront maintenus de façon stable dans un statut tolérogène in vivo et donc contourner les préoccupations d’instabilité in vivo qui sont associés à des DC tolérogènes générés in vitro (TolDCs)19,20,21. À cet égard, les TolDC sont également l’une des stratégies proposées pour l’augmentation in vivo des fonctions cellulaires Treg19,20,21. Pour soutenir notre raisonnement, nous avons montré que les DC s’est fait ingénieur, lors d’une livraison in vivo, peut augmenter l’induction des cellules Treg intestinales dans les tissus lymphoïdes périphériques6.
Un autre avantage de notre stratégie proposée est que 1,25 (OH)2D a également d’autres fonctions qui peuvent potentiellement bénéficier aux patients atteints de MII. Ces autres fonctions comprennent la capacité de 1,25 (OH)2D pour stimuler la sécrétion d’antimicrobiens22 et pour supprimer la carcinogenèse23. Les infections et les cancers sont fréquemment associés aux MII24,25.
Pour générer les DC qui peuvent produire localement des concentrations élevées de 1,25 (OH)2D et RA de novo, nous utilisons un vecteur lentiviral pour concevoir des DC pour surexprimer deux gènes. Un gène est la famille cytochrome P450 27 sous-famille B membre 1 (CYP27B1) qui code 25-hydroxyvitamine D 1-hydroxylase (1-hydroxylase), qui catalyse physiologiquement la synthèse de 1,25 (OH)2D. L’autre gène est la déhydrogénase d’aldéhyde 1 membre de la famille A2 (ALDH1a2) qui code la déhydrogénase rétinienne 2 (RALDH2), qui catalyse physiologiquement la synthèse de RA6.
Parce que l’augmentation in vivo de l’induction des cellules Treg intestinale est potentiellement importante dans le traitement des MII, dans le protocole suivant, nous détaillerons les procédures de production des DC de 1-hydroxylase-RALDH2-overexpressing (dC-CYP-ALDH) qui peut être utilisé pour l’étude future des cellules de Treg gut-homing in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans cet article nous décrivons l’utilisation des cellules de DC-CYP-ALDH, pour augmenter l’induction des cellules de Treg d’intestin-homing dans les tissus lymphoïdes périphériques. Nos données ont montré que les cellules DC-CYP-ALDH peuvent synthétiser localement des concentrations élevées de novo de 1,25 (OH)2D et RA in vitro en présence de substrats correspondants (c.-à-d. 25[OH]D et rétinol, respectivement). Puisque les concentrations suffisantes de sang de 25(OH)D et de rétinol peuvent être…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le Bureau du sous-secrétaire à la Défense pour les affaires de santé dans le cadre du Programme de recherche médicale révisé par les pairs dans le cadre du Prix No. W81XWH-15-1-0240 (XT). Les opinions, les interprétations, les conclusions et les recommandations sont celles de l’auteur et ne sont pas nécessairement approuvées par le ministère de la Défense. Ce travail a également été partiellement soutenu par des subventions pour l’innovation en recherche du Département de médecine de l’Université de Loma Linda (681207-2967 [XT et GG], 681205-2967 [XT], et 325491 [DJB]).
Materials
| 10 mL syringes | ThermoFisher Scientific | Cat# 03-377-23 | |
| 100 mm x 20 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430167 | |
| 12-well culture plates | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-200-82 | |
| 150 mm x 25 mm culture dishes | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430559 | |
| 25-hydroxycholecalciferol (25[OH]D) | Sigma-Aldrich | Cat# H4014 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| 2-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | Cat#: 21985023 | |
| 6-well culture plates | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-200-83 | |
| ALDEFLUOR kit | Stemcell Technologies | Cat# 01700 | |
| Anti-CYP27B1 | Abcam | Cat# ab95047 | |
| BD FACSAria II | BD Biosciences | N/A | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# C1016 | |
| CM-10-D cell culture medium | DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
| CM-10-R cell culture medium | RPMI 1640 medium (no glutamine) containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
| CM-4-D cell culture medium | DMEM medium containing 4% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine. | ||
| Corning bottle-top vacuum filters, 0.22 mM, 500 mL | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430513 | |
| Corning bottle-top vacuum filters, 0.45 mM, 500 mL | Sigma-Aldrich | Cat# CLS430514 | |
| Dissecting scissor | ThermoFisher Scientific | Cat# 08-940 | |
| DMEM medium | ThermoFisher Scientific | Cat# 11960044 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | Cat# 16000044 | |
| Forceps | ThermoFisher Scientific | Cat# 22-327379 | |
| Gibco ACK lysing buffer | ThermoFisher Scientific | Cat# A1049201 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | Cat# G5516 | |
| Goat anti-rabbit IgG | Abcam | Cat# ab205718 | |
| HEPES | Millipore | Cat# 391340 | |
| Lenti-CYP-ALDH | Custom-made | 1.6-kb mouse CYP27B1 and ALDH1a2 cDNAs were amplified by PCR using a plasmid containing the CYP27B1 cDNA and a plasmid containing the ALDH1a2 cDNA respectively (GeneCopoeia). The amplified CYP27B1 cDNA fragment with a 5' KOZAK ribosome entry sequence was cloned into the pRRL-SIN.cPPt.PGKGFP.WPRE lentiviral vector (Addgene). The resulting construct was designated as lenti-CYP-GFP. The amplified ALDH1a2 cDNA fragment was cloned into the lenti-CYP-GFP to replace the GFP and was designated as lenti-CYP-ALDH. This bicistronic plasmid expresses CYP27B1 controlled by SFFV promoter and ALDH1a2 controlled by PGK promoter. | |
| L-glutamine | ThermoFisher Scientific | Cat#25030081 | |
| Lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | Cat# L3755 | |
| Murine GM-CSF | Peprotech | Cat# 315-03 | |
| Murine IL-4 | Peprotech | Cat# 214-14 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | Cat# NIST2186II | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | Cat# S9888 | |
| Needles | ThermoFisher Scientific | Cat# 14-841-02 | |
| Nonessential Amino Acids | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11140076 | |
| pCMVR8.74 | Addgene | Plasmid# 22036 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | Cat#15140148 | |
| Phoshate Balanced Solution (PBS) | ThermoFisher Scientific | Cat#: 20012027 | |
| PMD2G | Addgene | Plasmid# 12259 | |
| Polypropylene tube, 15 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# AM12500 | |
| Polypropylene tube, 50 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# AM12502 | |
| Protamine sulfate | Sigma-Aldrich | Cat# P3369 | |
| Rabbit polycloncal IgG isotype control | Abcam | Cat# ab171870 | |
| Radioimmunoassay for 1,25(OH)2D measurement | Heartland Assays | ||
| RPMI 1640 medium, no glutamine | ThermoFisher Scientific | Cat# 21870076 | |
| Sodium pyruvat | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11360070 | |
| Sorvall Legend XTR Centrifuge | ThermoFisher Scientific | Cat# 75004521 | |
| Sterile Cell strainers, 40 mm | ThermoFisher Scientific | Cat# 07-201-430 | |
| Sterile storage bottles, 500 mL | ThermoFisher Scientific | Cat# CLS431432 |
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