التخبط والتضخم في الرئة الماوس لعلم الأنسجة الورم
Summary
الغرض من هذه الطريقة هو تقديم طريقة بسيطة وفعالة للتشويش والتضخم ، وثبات رئتي الماوس لفحص أمراض أورام الرئة وتقييم الانبثاث إلى الرئة.
Abstract
القدرة على تقييم الأنسجة الرئوية أمر بالغ الأهمية لمجالات أبحاث سرطان الرئة ونقائل السرطان. من المهم بنفس القدر إجراء عمليات التشريح بسرعة وكفاءة من الدراسات دون التضحية بجودة الأنسجة المشتراة. الهدف من هذا البروتوكول هو تقديم طريقة لتشويش وتضخيم وإصلاح رئتي الماوس بسرعة للتحليل النسيجي في المصب. ولا توحد هذه الطريقة تضخم الرئة؛ بل إنها لا توحد معدل التضخم في الرئة. وبالتالي، فإنه لا يتطلب أي إجراءات خاصة أو معدات وبدلا من ذلك ببساطة يغرس التثبيت مباشرة من خلال القصبة الهوائية بعد التغلغل من خلال القلب. وهذا يسمح لتقدير كاف لحجم الورم، والأنسجة، والتهديف. وهذا يسمح أيضا لجمع الأنسجة المجمدة قبل تثبيت أنسجة الرئة. هذه الطريقة محدودة من حيث أنها لا تسمح للقياس الكمي المورفومتري اللاحق للرئة. ومع ذلك، فهو أكثر من كاف لتحليل ورم الرئة من نماذج الماوس المعدلة وراثيا (GEMMs)، ونماذج syngeneic، فضلا عن دراسات ورم xenograft والانبثاث.
Introduction
توجد مجموعة متنوعة من نماذج الماوس من تكوين الرئة وانبثاث السرطان إلى الرئة بدءا من GEMMs المعقدة إلى النماذج المستحثة بالسرطان إلى نماذج سينجينيك وزينوغرافت ، حيث يتم حقن الخلايا السرطانية عن طريق داخل القلب أو داخل القلب أو الوريد الذيل أو طرق أخرى لإنشاء أورام داخل الرئة. تشترك جميع هذه النماذج في الحاجة المشتركة للتقييم النسيجي لأمراض الأنسجة الرئوية وعلم الأمراض. وبالتالي ، من الضروري أن يكون لديك طريقة قوية وسريعة لإجراء عمليات التشريح للفئران أثناء تغلغل الرئتين لإزالة الدم الزائد ، وتضخيم وإصلاح الرئتين لتصور بنية الرئة بوضوح. السرعة هي عنصر حاسم في هذا الإجراء لأنه قد يكون من الضروري جمع الرئتين من عشرات الفئران في نقطة زمنية واحدة. يمكن تنفيذ هذا الإجراء في أقل من 6 دقائق لكل ماوس.
في حين أن هذا الإجراء هو أكثر من كافية لتقييم الأنسجة الورم, لا ينصح لأولئك الذين يرغبون في إجراء قياسات مجسمة أو مورفومترية من الرئتين. تتطلب هذه القياسات توحيد تضخم الرئة ، وكذلك حساب المساحة السطحية المطلقة للرئة والحجم المطلق وحجم السنة المائية ورقم1. هذه الطريقة ليست أيضا الأمثل لبعض نهج التصوير. على سبيل المثال ، يتطلب تصوير الرئتين عن طريق μCT للتحليل المورفومتري السابق فيفو أن تظل الرئتين مملوءتين بالهواء2. عندما يكون الحفاظ على المساحات والأبعاد الهوائية هي الشاغل الرئيسي ، يوصى بإصلاح الرئتين عن طريق تقنيات الجفاف التروية3،4. واحدة من أكبر الشواغل لهذا النموذج هو احتمال تمزق الجدران الحويصلات، وتقليل استخدامه في دراسات انتفاخ الرئة. ومع ذلك ، فإن الإجراء الموصى به لتثبيت الرئتين لدراسة انتفاخ الرئة لا يزال مشابها تماما ، حيث يوصى بإصلاح الرئتين إما عن طريق غرس 10٪ من الفورمالين داخل الرحم (على غرار البروتوكول الموصوف هنا) تحت ضغط السوائل المستمر أو عن طريق التثبيت الموضعي5.
ميزة الإجراء الموصوف هنا هو أنه لا يتطلب ضغط السوائل المستمر ، بدلا من ذلك تضخيم الرئتين حتى تتوسع بشكل كامل ، وبالتالي تقليل الوقت اللازم لإجراء العملية. الإجراء الموصوف هنا يشبه إلى حد كبير الأساليب التي أوصت بها نزع السلاح من جمعية علم الأمراض السموم ، حيث تم تشكيل لجنة فرعية للتوصية بأفضل طرق تثبيت الرئة لدراسات السموم. أوصى غالبية العلماء داخل هذه اللجنة الفرعية بإصلاح الرئتين عن طريق غرس داخل الرحم بحقنة ، علىالرغممن وجود توصيات مختلفة حول الوقت الذي تركت فيه الرئة في التثبيت 6 . وهكذا ، في حين أن مجموعة متنوعة من أساليب تضخم الرئة والتثبيت موجودة ، يقترح أن تكون الطريقة الموصوفة هنا هي الطريقة المثلى لتضخيم وإصلاح الرئتين بسرعة لتقييم الهسطولوجيا الورم المصب.
Protocol
Representative Results
Discussion
الإجراء المذكور أعلاه لتشويش والتضخم ، وثبات رئتي الماوس مثالية لإعداد سريع وفعال لرئات الماوس لأنسجة ورم الرئة وتحليل علم الأمراض. الإجراء لا يتطلب أي معدات خاصة ويمكن أن يتم في أقل من 6 دقائق لكل ماوس. الإجراء لا يتطلب حجم ثابت للتضخم ولا ضغط السوائل المستمر. نظرا لأن هذا الإجراء غير موحد…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم الأبحاث التي تم الإبلاغ عنها في هذا المنشور من قبل المركز الوطني للنهوض بالعلوم التحويلية تحت رقم الجائزة UL1TR003096 (MDE) ، زمالة معهد القلب والرئة والدم الوطنية قبل الدكتوراه في برنامج التدريب على أمراض الرئة 5T32HL134640 (MLD).
Materials
| 10% buffered formalin | Fisher | 23-245685 | |
| 22 G Needle | BD | 305155 | |
| 3 mL syringe | BD | 309656 | |
| 70% Ethanol | Decon | 2405 | |
| Forceps | Harvard Apparatus | 72-8595 | |
| Heparin | Fisher | H19 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-030-CV | |
| Surgical scissors | Harvard Apparatus | 72-8428 |
References
- Hsia, C. C., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R., Structure, A. An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: standards for quantitative assessment of lung structure. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 394-418 (2010).
- Vasilescu, D. M., Knudsen, L., Ochs, M., Weibel, E. R., Hoffman, E. A. Optimized murine lung preparation for detailed structural evaluation via micro-computed tomography. Journal of Applied Physiology. 112 (1), 159-166 (2012).
- Blumler, P., Acosta, R. H., Thomas-Semm, A., Reuss, S. Lung fixation for the preservation of air spaces. Experimental Lung Research. 30 (1), 73-82 (2004).
- Oldmixon, E. H., Suzuki, S., Butler, J. P., Hoppin, F. G. Perfusion dehydration fixes elastin and preserves lung air-space dimensions. Journal of Applied Physiology. 58 (1), 105-113 (1985).
- Braber, S., Verheijden, K. A., Henricks, P. A., Kraneveld, A. D., Folkerts, G. A comparison of fixation methods on lung morphology in a murine model of emphysema. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 299 (6), 843-851 (2010).
- Renne, R., et al. Recommendation of optimal method for formalin fixation of rodent lungs in routine toxicology studies. Toxicologic Pathology. 29 (5), 587-589 (2001).
- Limjunyawong, N., Mock, J., Mitzner, W. Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research. Journal of Visualized Experiments. (102), e52964 (2015).
- Lum, H., Mitzner, W. Effects of 10% formalin fixation on fixed lung volume and lung tissue shrinkage. A comparison of eleven laboratory species. American Review of Respiratory Disease. 132 (5), 1078-1083 (1985).
- Edmonds, M. D., et al. MicroRNA-31 initiates lung tumorigenesis and promotes mutant KRAS-driven lung cancer. Journal of Clinical Investigation. 126 (1), 349-364 (2016).
- Zhao, K., et al. Wogonin suppresses melanoma cell B16-F10 invasion and migration by inhibiting Ras-medicated pathways. PLoS One. 9 (9), 106458 (2014).
