Perfusion und Inflation der Mauslunge für Tumorhistologie
Summary
Der Zweck dieser Methode ist es, eine einfache und effiziente Methode für die Perfusion, Inflation und Fixierung von Mauslungen für die Untersuchung der Lungentumorpathologie und die Bewertung von Metastasen an der Lunge zu präsentieren.
Abstract
Die Fähigkeit, die Lungenhistologie zu bewerten, ist entscheidend für die Bereiche Lungenkrebsforschung und Krebsmetastasierung. Ebenso wichtig ist es, Nekropsien schnell und effizient aus Studien durchzuführen, ohne die Qualität des beschafften Gewebes zu beeinträchtigen. Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine Methode zur schnellen Durchlässigkeit, Aufblasung und Fixierung von Mauslungen für die nachgelagerte histologische Analyse zu präsentieren. Diese Methode standardisiert die Lungeninflation nicht; daher erfordert es keine speziellen Verfahren oder Ausrüstung und stattdessen nur fixierend direkt durch die Luftröhre nach Perfusion durch das Herz. Dies ermöglicht eine ausreichende Schätzung der Tumorgröße, Histologie und Bewertung. Dies ermöglicht auch die Sammlung von gefrorenem Gewebe vor der Lungengewebefixierung. Diese Methode ist insofern eingeschränkt, als sie eine spätere morphometrische Quantifizierung der Lunge nicht zulässt; Es reicht jedoch mehr als aus für Lungentumoranalysen aus gentechnisch veränderten Mausmodellen (GEMMs), syngene Modelle sowie Xenograft-Tumor- und Metastasenstudien.
Introduction
Eine Vielzahl von Mausmodellen der Lungenonkogenese und Krebsmetastasen in die Lunge gibt es von komplexen GEMMs über krebserregende Modelle bis hin zu syngenischen und Xenograft-Modellen, bei denen Krebszellen über intrakardiale, intrathorakale, die Schwanzvene oder andere Methoden zur Etablierung von Tumoren in der Lunge injiziert werden. Alle diese Modelle teilen die gemeinsame Notwendigkeit der histologischen Bewertung der Lungenhistologie und Pathologie. Daher ist es notwendig, eine robuste, aber schnelle Methode zu haben, um Nekropsien von Mäusen durchzuführen, während die Lunge durchsetzt wird, um überschüssiges Blut zu entfernen, und die Lunge aufzublasen und zu fixieren, um die Lungenarchitektur klar zu visualisieren. Geschwindigkeit ist ein kritischer Bestandteil dieses Verfahrens, da es notwendig sein kann, die Lunge von Dutzenden von Mäusen zu einem einzigen Zeitpunkt zu sammeln. Dieses Verfahren kann in weniger als 6 Minuten pro Maus durchgeführt werden.
Während dieses Verfahren mehr als ausreichend für die Bewertung der Tumorhistologie ist, wird es nicht für diejenigen empfohlen, die stereologische oder morphometrische Messungen der Lunge durchführen möchten. Solche Messungen erfordern eine Standardinflation der Lunge, ebenso wie die Berechnung der absoluten Oberfläche der Lunge, des absoluten Volumens und der Alveolargröße und der Zahl1. Diese Methode ist auch nicht optimal für einige bildgebende Ansätze. Zum Beispiel erfordert die Bildgebung der Lunge über die “CT” für die ex vivo morphometrische Analyse, dass die Lunge mit Luft gefüllt bleibt2. Wenn die Erhaltung von Lufträumen und Abmessungen das Hauptanliegen ist, wird empfohlen, die Lunge durch Perfusionsdehydrierungstechniken3,4zu fixieren. Eines der größten Anliegen dieses Modells ist das Potenzial für das Brechen der Alveolarwände, die seine Verwendung in Studien von Emphysem enden; Das empfohlene Verfahren zur Fixierung der Lunge zur Untersuchung von Emphysem ist jedoch noch recht ähnlich, da es empfohlen wird, die Lunge entweder durch intratracheale Instillation von 10% Formalin (ähnlich dem hier beschriebenen Protokoll) unter konstantem Flüssigkeitsdruck oder durch In-situ-Fixierung5zu fixieren.
Der Vorteil des beschriebenen Verfahrens besteht hier darin, dass es keinen konstanten Flüssigkeitsdruck erfordert, sondern die Lunge aufbläht, bis sie sich vollständig erweitert hat, wodurch die für das Verfahren benötigte Zeit verringert wird. Das hier beschriebene Verfahren ähnelt den Methoden, die von einem Rüstungsarium der Gesellschaft für Toxikologische Pathologie empfohlen werden, wo ein Unterausschuss gebildet wurde, um die besten Methoden der Lungenfixierung für toxikologische Studien zu empfehlen. Die Mehrheit der Wissenschaftler in diesem Unterausschuss empfahl, die Lunge durch intratracheale Instillation mit einer Spritze zu fixieren, obwohl es unterschiedliche Empfehlungen für die Zeit gab, zu der die Lunge imfixativen 6belassen wurde. Während es also eine Vielzahl von Methoden der Lungeninflation und -fixierung gibt, wird die hier beschriebene Methode als optimale Methode vorgeschlagen, um die Lunge schnell aufzublasen und für die nachgeschaltete tumorhistologische Bewertung zu fixieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das oben beschriebene Verfahren zur Perfusion, Inflation und Fixierung der Mauslungen ist ideal für die schnelle und effiziente Vorbereitung der Mauslungen für die Lungentumorhistologie und Pathologieanalyse. Das Verfahren erfordert keine spezielle Ausrüstung und kann in weniger als 6 Minuten pro Maus durchgeführt werden. Das Verfahren erfordert weder ein festes Volumen für die Inflation noch einen konstanten Flüssigkeitsdruck. Da dieses Verfahren nicht standardisiert ist, wird es nicht für diejenigen empfohlen, d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die in dieser Publikation berichtete Forschung wurde vom National Center for Advancing Translational Sciences unter der AuszeichnungUL1TR003096 (MDE), National Heart, Lung, and Blood Institute Predoctoral Fellowship in Lung Diseases Training Program 5T32HL134640 (MLD) unterstützt.
Materials
| 10% buffered formalin | Fisher | 23-245685 | |
| 22 G Needle | BD | 305155 | |
| 3 mL syringe | BD | 309656 | |
| 70% Ethanol | Decon | 2405 | |
| Forceps | Harvard Apparatus | 72-8595 | |
| Heparin | Fisher | H19 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-030-CV | |
| Surgical scissors | Harvard Apparatus | 72-8428 |
References
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