Perfusion et inflation du poumon de souris pour l’histologie de tumeur
Summary
Le but de cette méthode est de présenter une méthode simple et efficace pour la perfusion, l’inflation, et la fixation des poumons de souris pour l’examen de la pathologie de tumeur de poumon et l’évaluation des métastases au poumon.
Abstract
La capacité d’évaluer l’histologie pulmonaire est essentielle pour les domaines de la recherche sur le cancer du poumon et de la métastase du cancer. Il est tout aussi important d’effectuer des autopsies rapidement et efficacement à partir d’études sans sacrifier la qualité des tissus obtenus. Le but de ce protocole est de présenter une méthode pour imprèfler, gonfler et fixer rapidement les poumons de souris pour l’analyse histologique en aval. Cette méthode ne normalise pas l’inflation pulmonaire; ainsi, il ne nécessite pas de procédures spéciales ou d’équipement et instille simplement fixatif directement par la trachée suite à la perfusion à travers le cœur. Ceci permet l’estimation suffisante de la taille de tumeur, de l’histologie, et de la notation. Cela permet également la collecte de tissus congelés avant la fixation des tissus pulmonaires. Cette méthode est limitée en ce qu’elle ne permet pas une quantification morphométrique ultérieure du poumon; cependant, il est plus que suffisant pour l’analyse de tumeur de poumon des modèles génétiquement modifiés de souris (GEMMs), des modèles syngeneic, aussi bien que des études de tumeur de xénogreffe et de métastase.
Introduction
Il existe une variété de modèles murin d’oncogenèse pulmonaire et de métastase du cancer au poumon, allant des GEMM complexes aux modèles induits par les carcinogènes en passant par les modèles syngénétiques et xénogreffes, où les cellules cancéreuses sont injectées par intracardiaque, intrathoracique, veine de queue ou d’autres méthodes pour établir des tumeurs dans le poumon. Tous ces modèles partagent le besoin commun d’évaluation histologique de l’histologie et de la pathologie pulmonaires. Ainsi, il est nécessaire d’avoir une méthode robuste mais rapide pour effectuer des autopsies de souris tout en perfusant les poumons pour éliminer l’excès de sang, et en gonflant et en fixant les poumons pour visualiser clairement l’architecture pulmonaire. La vitesse est un élément essentiel de cette procédure car il peut être nécessaire de recueillir les poumons de dizaines de souris à un seul moment. Cette procédure peut être effectuée en moins de 6 minutes par souris.
Tandis que cette procédure est plus que suffisante pour évaluer l’histologie de tumeur, elle n’est pas recommandée pour ceux qui souhaitent exécuter la stéréologie ou les mesures morphométriques des poumons. De telles mesures exigent que l’inflation pulmonaire soit normalisée, tout comme le calcul de la surface absolue du poumon, du volume absolu et de la taille et du nombre alvéolés1. Cette méthode n’est pas non plus optimale pour certaines approches d’imagerie. Par exemple, l’imagerie des poumons par μCT pour l’analyse morphométrique ex vivo exige que les poumons restent remplis d’air2. Lorsque la préservation des espaces et des dimensions de l’air est la principale préoccupation, il est recommandé de fixer les poumons par des techniques de déshydratation par perfusion3,4. L’une des plus grandes préoccupations de ce modèle est le potentiel de rupture des parois alvéollaires, ce qui a pour effet de réduire son utilisation dans les études sur l’emphysème; cependant, la procédure recommandée pour la fixation des poumons pour l’étude de l’emphysème est encore assez semblable, car il est recommandé de fixer les poumons soit par instillation intratracheal de 10% de formaline (semblable au protocole décrit ici) sous pression fluide constante ou par fixation in situ5.
L’avantage de la procédure décrite ici est qu’elle ne nécessite pas de pression constante du fluide, au lieu de gonfler les poumons jusqu’à ce qu’ils aient complètement augmenté, diminuant ainsi le temps nécessaire pour la procédure. La procédure décrite ici ressemble beaucoup aux méthodes recommandées par un armamentarium de la Society of Toxicologic Pathology, où un sous-comité a été formé pour recommander les meilleures méthodes de fixation pulmonaire pour les études toxicologiques. La majorité des scientifiques de ce sous-comité ont recommandé de fixer les poumons par instillation intratrachéale avec une seringue, bien qu’il y ait eu des recommandations variables sur le moment où le poumon a été laissé dans le fixatif6. Ainsi, tandis qu’une série de méthodes d’inflation et de fixation de poumon existent, la méthode décrite ci-après est proposée pour être la méthode optimale pour gonfler et fixer rapidement les poumons pour l’évaluation histologique en aval de tumeur.
Protocol
Representative Results
Discussion
La procédure décrite ci-dessus pour la perfusion, l’inflation, et la fixation des poumons de souris est idéale pour la préparation rapide et efficace des poumons de souris pour l’histologie de tumeur pulmonaire et l’analyse de pathologie. La procédure ne nécessite aucun équipement spécial et peut être effectuée en moins de 6 minutes par souris. La procédure ne nécessite pas de volume fixe pour l’inflation ni de pression fluide constante. Puisque cette procédure n’est pas normalisée, elle n’est p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les recherches rapportées dans cette publication ont été soutenues par le National Center for Advancing Translational Sciences sous le numéro ul1TR003096 (MDE), National Heart, Lung, and Blood Institute Predoctoral Fellowship in Lung Diseases Training Program 5T32HL134640 (MLD).
Materials
| 10% buffered formalin | Fisher | 23-245685 | |
| 22 G Needle | BD | 305155 | |
| 3 mL syringe | BD | 309656 | |
| 70% Ethanol | Decon | 2405 | |
| Forceps | Harvard Apparatus | 72-8595 | |
| Heparin | Fisher | H19 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-030-CV | |
| Surgical scissors | Harvard Apparatus | 72-8428 |
References
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