Perfusjon og inflasjon av musen lunge for tumor histologi

Summary

Formålet med denne metoden er å presentere en enkel og effektiv metode for perfusjon, inflasjon og fiksering av muse lunger for undersøkelse av lungesvulstpatologi og evaluering av metastaser til lungen.

Abstract

Evnen til å evaluere lunge histologi er avgjørende for feltene lungekreftforskning og kreftmetastase. Det er like viktig å utføre nekropsier raskt og effektivt fra studier uten å ofre kvaliteten på vevet som er anskaffet. Målet med denne protokollen er å presentere en metode for raskt å parfyme, blåse opp og fikse muse lunger for nedstrøms histologisk analyse. Denne metoden standardiserer ikke lungeinflasjon; Dermed krever det ingen spesielle prosedyrer eller utstyr og innpoder i stedet bare fiksering direkte gjennom luftrøret etter perfusjon gjennom hjertet. Dette gir tilstrekkelig estimering av tumorstørrelse, histologi og scoring. Dette gjør det også mulig å samle frossent vev før lungevevsfiksering. Denne metoden er begrenset ved at den ikke tillater senere morfometrisk kvantifisering av lungen; Det er imidlertid mer enn tilstrekkelig for lungesvulstanalyse fra genmodifiserte musemodeller (GEMMs), syngeneiske modeller, samt xenograft tumor- og metastaseringsstudier.

Introduction

En rekke musemodeller av lunge onkogenese og kreftmetastase til lungen eksisterer alt fra komplekse GEMMs til kreftfremkallende modeller til syngeneiske og xenografte modeller, hvor kreftceller injiseres via intrakarakum, intrathoracic, halevenen eller andre metoder for å etablere svulster i lungen. Alle disse modellene deler det felles behovet for histologisk evaluering av lunge histologi og patologi. Dermed er det nødvendig å ha en robust, men rask metode for å utføre nekropsier av mus mens du parfymerer lungene for å fjerne overflødig blod, og oppblåse og fikse lungene for å tydelig visualisere lungearkitektur. Hastighet er en kritisk komponent i denne prosedyren, da det kan være nødvendig å samle lungene fra dusinvis av mus på et enkelt tidspunkt. Denne prosedyren kan utføres på mindre enn 6 minutter per mus.

Selv om denne prosedyren er mer enn tilstrekkelig for evaluering av tumor histologi, anbefales det ikke for de som ønsker å utføre stereologi eller morfometriske målinger av lungene. Slike målinger krever at lungeinflasjonen standardiseres, det samme gjør beregningen av absolutt overflateareal i lungen, absolutt volum og alveolarstørrelse og nummer¹. Denne metoden er heller ikke optimal for enkelte avbildningsmetoder. For eksempel krever avbildning av lungene via μCT for ex vivo morfometrisk analyse at lungene forblir fylt med luft². Når bevaring av luftrom og dimensjoner er den primære bekymringen, anbefales det å fikse lungene ved perfusjonsdehydreringsteknikker^3,4. En av de største bekymringene for denne modellen er potensialet for rupturing av alveolarveggene, noe som reduserer bruken i studier av emfysem; Den anbefalte prosedyren for fiksering av lunger for studiet av emfysem er imidlertid fortsatt ganske lik, da det anbefales å fikse lungene enten ved intratrakeal instillasjon av 10% formalin (ligner protokollen beskrevet her) under konstant væsketrykk eller ved in situ fiksering⁵.

Fordelen med den beskrevne prosedyren her er at den ikke krever konstant væsketrykk, i stedet oppblåser lungene til de er fullstendig utvidet, og dermed reduserer tiden som trengs for prosedyren. Prosedyren her beskrevet ligner på metodene anbefalt av et armamentarium av Society of Toxicologic Pathology, hvor en underkomité ble dannet for å anbefale de beste metodene for lungefiksering for toksikologistudier. Flertallet av forskerne i denne underkomiteen anbefalte å fikse lungene ved intratrakeal instillasjon med en sprøyte, selv om det var varierende anbefalinger om tidspunktet lungen ble igjen i fixative⁶. Således, mens en rekke metoder for lungeinflasjon og fiksering eksisterer, foreslås metoden beskrevet heri å være den optimale metoden for raskt å blåse opp og fikse lungene for nedstrøms tumor histologisk evaluering.

Protocol

Alle metoder beskrevet her er godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Alabama i Birmingham. 1. Eksperimentell protokoll Ofre musen ved hjelp av en godkjent IACUC-metode. Her brukte vi cervical dislokasjon av en mus bedøvet med 5% isofluran. Bruk en passende mus for studien; her bruker vi en 8 uker gammel FVB-mus Bruk kirurgisk saks, lag et 3,5-5 mm horisontalt snitt midt i underlivet. Deretter setter du inn kirurgisk saks i det lil…

Representative Results

Ovennevnte protokoll gir rask perfusjon, inflasjon og fiksering av muse lunger. Tallene nedenfor representerer viktigheten av hvert trinn. Figur 1 viser H&E-fargede lunger som har blitt parfymert med PBS og lunger der perfusjonstrinnet er hoppet over eller lungene ikke har parfymert seg riktig. Som vist skaper overflødig blod i de dårlig perfused lungene mindre enn ideell histologi og kan gjøre det utfordrende å observere lungearkitekturen fullt ut. Figur 2 …

Discussion

Prosedyren beskrevet ovenfor for perfusjon, inflasjon og fiksering av muse lunger er ideell for rask og effektiv forberedelse av muse lunger for lungesvulst histologi og patologi analyse. Prosedyren krever ikke noe spesialutstyr og kan utføres på mindre enn 6 minutter per mus. Prosedyren krever ikke et fast volum for inflasjon eller konstant væsketrykk. Fordi denne prosedyren ikke er standardisert, anbefales det ikke for de som ønsker å utføre stereologiske eller morfometriske analyser av lungen. Prosedyrer der sli…

Materials

10% buffered formalin	Fisher	23-245685
22 G Needle	BD	305155
3 mL syringe	BD	309656
70% Ethanol	Decon	2405
Forceps	Harvard Apparatus	72-8595
Heparin	Fisher	H19
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Corning	21-030-CV
Surgical scissors	Harvard Apparatus	72-8428