Screening auf Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitoren
Summary
Hier stellen wir ein Screening-Verfahren für membrangebundene Pyrophosphatase (aus Thermotoga maritima) Inhibitoren auf Basis der Molybdän-Blaureaktion in einem 96-Well-Plattenformat vor.
Abstract
Membrangebundene Pyrophosphatasen (mPPases) sind dimere Enzyme, die in Bakterien, Archaeen, Pflanzen und protistischen Parasiten vorkommen. Diese Proteine spalten Pyrophosphat in zwei Orthophosphatmoleküle, die mit Proton und/oder Natriumionen gekoppelt sind, die über die Membran pumpen. Da bei Tieren und Menschen keine homologen Proteine vorkommen, sind mPPases gute Kandidaten bei der Gestaltung potenzieller Wirkstoffziele. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zum Abschirmen für mPPase-Inhibitoren unter Verwendung der Molybdän-Blaureaktion in einem 96-Well-Plattensystem vor. Wir verwenden mPPase aus dem thermophilen Bakterium Thermotoga maritima (TmPPase) als Modellenzym. Dieses Protokoll ist einfach und kostengünstig und führt zu einem konsistenten und robusten Ergebnis. Es dauert nur etwa eine Stunde, um das Aktivitätstestprotokoll vom Beginn des Assays bis zur Absorptionsmessung abzuschließen. Da die in diesem Test erzeugte blaue Farbe über einen längeren Zeitraum stabil ist, können nachfolgende Assays unmittelbar nach der vorherigen Charge durchgeführt werden, und die Absorption kann später für alle Chargen auf einmal gemessen werden. Der Nachteil dieses Protokolls ist, dass es manuell durchgeführt wird und somit anstrengend sein kann und gute Fähigkeiten der Pipetten und Zeiterfassung erfordern. Darüber hinaus enthält die in diesem Test verwendete Arsenit-Citrat-Lösung Natriumarsenit, das giftig ist und mit den notwendigen Vorsichtsmaßnahmen behandelt werden sollte.
Introduction
Ungefähr 25% der gesamten zellulären Proteine sind Membranproteine und etwa 60% von ihnen sind Arzneimittelziele1,2. Eines der potentiellen Wirkstoffziele3, membrangebundene Pyrophosphatasen (mPPases), sind dimerische Enzyme, die Proton und/oder Natriumion durch Hydrolyse von Pyrophosphat in zwei Orthophosphatepumpen 4. mPPases können in verschiedenen Organismen gefunden werden5 wie Bakterien, Archaeen, Pflanzen und protistische Parasiten, mit Ausnahme von Menschen und Tieren4. Bei protistischen Parasiten, z.B. Plasmodium falciparum, Toxoplasma gondii und Trypanosoma brucei, sind mPPases wesentlich für die Parasitenvirulenz6 und Knockout dieser Expression in den Parasiten führen zu einem Versagen bei der Aufrechterhaltung des intrazellulären pH bei Exposition gegenüber dem externen Grund-pH7. Aufgrund ihrer Bedeutung und des Mangels an homologem Protein, das bei Wirbeltieren vorhanden ist, können mPPases als potenzielle Wirkstoffziele für protistale Erkrankungen betrachtet werden3.
Das In-vitro-Screening von mPPase-Inhibitoren in dieser Arbeit basiert auf einem TmPPase-Modellsystem. TmPPase ist ein Natriumionenpumpen und kaliumionenabhängige mPPase von T. maritima und hat seine optimale Aktivität bei 71 °C8. Vorteile dieses Enzyms sind zum Beispiel seine einfache Produktion und Reinigung, gute thermische Stabilität und hohe spezifische Aktivität. TmPPase weist sowohl eine hohe Ähnlichkeit neben der vollständigen Erhaltung der Position als auch die Identität aller katalytischen Rückstände zu den protistischen mPPases3,9 und der gelösten Struktur von Vigna radiata10 mPPase auf. Die verfügbaren Strukturen von TmPPase in verschiedenen Konformationen sind auch für strukturbasierte Drogendesign-Experimente (als virtuelles Screening und de novo Design) nützlich.
Hier berichten wir über ein detailliertes Protokoll zum Screening von TmPPase-Inhibitoren in einem 96-Well-Plattenformat (Abbildung 1). Das Protokoll basiert auf der kolorimetrischen Methode der Molybdänblaureaktion, die zuerst von Fiske und Subbarow11entwickelt wurde. Bei dieser Methode wird 12-phosphomolybdische Säure aus Orthophosphat und Molybdat unter sauren Bedingungen entsteht, die dann reduziert wird, um charakteristische blau gefärbte Phosphomolybdänarten12zu geben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier berichten wir über ein detailliertes Protokoll zum einfachen Screening von Inhibitoren auf membrangebundene Pyrophosphatase aus T. maritima in einem 96-Well-Plattenformat auf Basis von Vidilaseris et al.14. Dieses Protokoll ist kostengünstig und basiert auf 12-Phosphomolybdadsäure, die aus Orthophosphat und Molybdat unter sauren Bedingungen gebildet und auf Phosphomolybdän-Arten mit einer deutlichen blauen Farbe12reduziert wird. Diese Methode wird gegenüb…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch die Stipendien der Jane and Aatos Erkko Foundation und der BBSRC (BB/M021610) an Adrian Goldman, die Akademie Finnlands (Nr. 308105) an Keni Vidilaseris,(Nr. 310297) an Henri Xhaard und (Nr. 265481) an Jari Yli-Kauhaluoma und die Forschungsfonds der Universität Helsinki an Gustav Boije af Gennäs. Die Autoren danken Bernadette Gehl für ihre technische Hilfe während des Projekts.
Materials
| Adhesive sealing sheet | Thermo Scientific | AB0558 | |
| Ammonium heptamolybdate tetrahydrate | Merck | F1412481 636 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | 95212-250G | |
| BioLite 96Well Multidish | Thermo Scientific | 130188 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Merck | 1167431000 | |
| 8-well PCR Tube Strips 0.2 ml without caps (120) | Nippon genetics | FG-028 | |
| Dodecyl maltoside (DDM) | Melford | B2010-100G | |
| Ethanol | Merck | 1009901001 | |
| Glacial acetic acid | Merck | 1000631011 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | |
| Imidodiphosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | I0631-1G | |
| L-α-Phosphatidyl choline from soybean lecithin | Sigma | 429415-100GM | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 8147330500 | |
| Multiplate 96-Well PCR Plates | Bio-Rad | MLL9651 | |
| MultiSkan Go | Thermo Scientific | 10680879 | |
| Nepheloskan Ascent (Type 750) | Labsystems | ||
| Polystyrene Petri dish (size 150 mm x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5981-100EA | |
| Potassium chloride | Merck | 104936 | |
| Prism 6 software | GraphPad | ||
| QBT2 Heating block | Grant Instruments | ||
| Sodium meta-arsenite | Fisher Chemical | 12897692 | |
| Sodium phosphate dibasic (Pi) | Sigma | S0876-1KG | |
| Sodium pyrophosphate dibasic | Fluka | 71501-100G | |
| Trisodium citrate dihydrate | Fluka | 71404-1KG |
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