써모토가 마리티마 멤브레인 경계 파이로포스파타제 억제제 스크리닝
Summary
여기에서 우리는 96 웰 플레이트 포맷에서 몰리브덴 청색 반응에 기초한 막 결합 된 열광파타제 (Thermotoga maritima에서)억제제에 대한 스크리닝 방법을 제시한다.
Abstract
막 결합 된 열광파타제 (mPPases)는 박테리아, 고고학, 식물 및 프로티스트 기생충에서 발생하는 디메라 효소입니다. 이 단백질은 양성자 및 /또는 나트륨 이온이 막을 가로 질러 펌핑과 결합된 두 개의 정형 외과 인산염 분자로 파이로 포스페이트를 갈라. 동물과 인간에서 상동성 단백질이 발생하지 않았기 때문에 mPPases는 잠재적인 약물 표적의 설계에 좋은 후보입니다. 여기서 우리는 96 웰 플레이트 시스템에서 몰리브덴 청색 반응을 활용하는 mPPase 억제제에 대한 상세한 프로토콜을 제시한다. 우리는 모델 효소로 열성 박테리아 써모토가 마리티마 (TmPPase)에서 mPPase를 사용합니다. 이 프로토콜은 간단하고 저렴하여 일관되고 강력한 결과를 생성합니다. 분석의 시작부터 흡광도 측정까지 활성 분석 프로토콜을 완료하는 데 약 1시간 밖에 걸리지 않습니다. 이 분석에서 생성된 청색은 오랜 기간 동안 안정되기 때문에, 후속 분석은 이전 배치 직후에 수행될 수 있으며, 흡광도는 나중에 모든 배치에 대해 한 번에 측정될 수 있다. 이 프로토콜의 단점은 수동으로 수행되므로 파이펫팅 및 시간 유지의 좋은 기술을 필요로 할뿐만 아니라 소진 될 수 있다는 것입니다. 또한,이 분석법에 사용되는 비소 – 구연산염 용액은 독성이 있으며 필요한 예방 조치로 처리되어야하는 나트륨 비소염을 포함합니다.
Introduction
총 세포 단백질의 약 25%는 막 단백질이고 그 중 약 60%는 약물 표적1,2입니다. 잠재적인 약물 표적 중 하나인3,막 결합 된 열광파타스 (mPPases)는 양성자 및 / 또는 나트륨 이온을 두 개의 정형 외과 인산염으로 열분해하여 막을 가로 질러 펌핑하는효소입니다 4. mPPases는 인간과동물을제외하고 박테리아, 고고학, 식물 및 프로티스트 기생충과 같은 다양한 유기체5에서 발견될 수 있습니다 4. 프로티스트 기생충에서, 예를 들어 플라스모듐 팔시파룸, 톡소플라즈마 곤디, 트리파노소마 브루시,mPPases는 기생충 에서 이러한 발현의 결손증6 및 녹아웃에 필수적이며 외부 기본pH7에노출시 세포내 pH를 유지하는 데 실패로 이어진다. 척추동물에 존재하는 상동 단백질의 중요성과 부족으로 인해 mPPases는 프로티스탈 질환에 대한 잠재적 인 약물 표적으로 간주 될 수 있습니다3.
이 작품에서 mPPase 억제제의 시험관 내 스크리닝은 TmPPase 모델 시스템을 기반으로 합니다. TmPPase는 T. 마리티마에서 나트륨 이온 펌핑 및 칼륨 이온 의존 mPPase이며 71 °C8에서최적의 활성을 갖는다. 이 효소의 장점은 예를 들어 생산 및 정제의 용이성, 좋은 열 안정성 및 높은 특정 활성입니다. TmPPase는 프로티스트 mPPases3,9 및 비냐 라디에타10 mPPase의 해결 된 구조에 대한 모든 촉매 잔류물의 완전한 보존뿐만 아니라 위치의 완전한 보존뿐만 아니라 높은 유사성을 나타낸다. 다른 적합성에서 TmPPase의 사용 가능한 구조는 구조 기반 약물 설계 실험 (가상 스크리닝 및 de novo 설계)에도 유용합니다.
여기서 우리는 96 웰 플레이트 포맷으로 TmPPase 억제제의 스크리닝을 위한 상세한 프로토콜을 보고한다(도1). 이 프로토콜은 먼저 Fiske 및 Subbarow11에의해 개발된 몰리브덴 청색 반응의 대색 방법을 기반으로 합니다. 이 방법은 산성 조건 하에서 정형 외과 스포산염및 몰리브데이트에서 12-인산성 산의 형성을 수반하며, 이는 특징적인 청색 인화질 종12종을주기 위해 감소된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서 우리는 Vidilaseris 등14에근거를 둔 96 개의 웰 플레이트 포맷에서 T. maritima에서 막 결합 된 열성 포에 대한 억제제의 간단한 스크리닝을위한 상세한 프로토콜을보고합니다. 이 프로토콜은 저렴하고 산성 조건하에서 정형 외과 및 몰리브데이트에서 형성되고 뚜렷한 청색12를가진 인산염 종으로 감소되는 12-포스포모모리브딕 산을 기반으로 합니다….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 제인과 아토스 에르코 재단과 BBSRC (BB / M021610)의 보조금에 의해 지원되었다, 핀란드 아카데미(308105번)에서 케니 비디라리스(310297번)에서 헨리 샤드까지, (265481번) 사리 일리-카우할루마, 헬싱키 대학 연구 기금에서 구스타프 보이예 af Gennäs. 저자는 프로젝트 기간 동안 그녀의 기술적 인 도움에 대한 버나데트 겔에게 감사드립니다.
Materials
| Adhesive sealing sheet | Thermo Scientific | AB0558 | |
| Ammonium heptamolybdate tetrahydrate | Merck | F1412481 636 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | 95212-250G | |
| BioLite 96Well Multidish | Thermo Scientific | 130188 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Merck | 1167431000 | |
| 8-well PCR Tube Strips 0.2 ml without caps (120) | Nippon genetics | FG-028 | |
| Dodecyl maltoside (DDM) | Melford | B2010-100G | |
| Ethanol | Merck | 1009901001 | |
| Glacial acetic acid | Merck | 1000631011 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | |
| Imidodiphosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | I0631-1G | |
| L-α-Phosphatidyl choline from soybean lecithin | Sigma | 429415-100GM | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 8147330500 | |
| Multiplate 96-Well PCR Plates | Bio-Rad | MLL9651 | |
| MultiSkan Go | Thermo Scientific | 10680879 | |
| Nepheloskan Ascent (Type 750) | Labsystems | ||
| Polystyrene Petri dish (size 150 mm x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5981-100EA | |
| Potassium chloride | Merck | 104936 | |
| Prism 6 software | GraphPad | ||
| QBT2 Heating block | Grant Instruments | ||
| Sodium meta-arsenite | Fisher Chemical | 12897692 | |
| Sodium phosphate dibasic (Pi) | Sigma | S0876-1KG | |
| Sodium pyrophosphate dibasic | Fluka | 71501-100G | |
| Trisodium citrate dihydrate | Fluka | 71404-1KG |
References
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