Скрининг для Термотога маритима Мембрана-Связанные пирофосфаза ингибиторы
Summary
Здесь мы представляем метод скрининга для мембранной связаны пирофосфатазы (от Thermotoga maritima) ингибиторы на основе молибдена синяя реакция в 96 хорошо пластины формате.
Abstract
Мембрана связаны пирофосфазазов (mPPases) являются димерические ферменты, которые встречаются в бактериях, археях, растений и протист паразитов. Эти белки расщепивают пирофосфат на две молекулы ортофосфата, которые соединяют с протоном и/или ионом натрия, перекачивающимися по мембране. Поскольку никаких гомологических белков не происходит у животных и людей, mPPases являются хорошими кандидатами в разработке потенциальных целей наркотиков. Здесь мы представляем подробный протокол для проверки ингибиторов mPPase с использованием молибдена синяя реакция в 96 хорошо пластины системы. Мы используем mPPase из термофильной бактерии Thermotoga maritima (TmPPase) в качестве образцового фермента. Этот протокол прост и недорог, что дает стабильный и надежный результат. Завершение протокола оценки активности занимает всего около часа с начала ассеидов до измерения абсорбции. Так как синий цвет, произведенный в этом анализе, стабилен в течение длительного периода времени, последующий анализ (ы) может быть выполнен сразу после предыдущей партии, а абсорбция может быть измерена позже для всех партий сразу. Недостатком этого протокола является то, что это делается вручную и, таким образом, может быть утомительным, а также требуют хороших навыков пайпеттинга и хранения времени. Кроме того, раствор арсенита,цитрата, используемый в этом ассее, содержит арсенит натрия, который является токсичным и должен быть обработан с необходимыми мерами предосторожности.
Introduction
Приблизительно 25% от общего количества клеточных белков являются мембранными белками и около 60% из них являются лекарственными целями1,2. Одной из потенциальных целей препарата3, мембранно-связанных пирофосфатазы (mPPases), являются димерические ферменты, которые перекачивают протон и / или ион натрия через мембрану путем гидролизза пирофосфата в два ортофосфата4. mPPases можно найти в различных организмах5, таких как бактерии, археи, растения и протеистовые паразиты, за исключением людей и животных4. В протеист паразитов, например Plasmodium falciparum, Toxoplasma gondii и Trypanosoma brucei, mPPases имеют важное значение для паразита вирулентности6 и нокаут этого выражения у паразитов привести к сбою в поддержании внутриклеточного рН при воздействии на внешние основные рН7. Из-за их важности и отсутствия гомологиального белка, присутствующем у позвоночных, mPPases можно рассматривать в качестве потенциальных целей препарата для протистальных заболеваний3.
Скрининг ингибиторов mPPase в пробирке в этой работе основан на модели системы TmPPase. TmPPase является натрия ионнасоса и калий ионзависимых mPPase от T. maritima и имеет свою оптимальную активность на 71 C8. Преимуществами этого фермента являются, например, его легкость в производстве и очистке, хорошая тепловая устойчивость и высокая специфическая активность. TmPPase показывает как высокое сходство в дополнение к полному сохранению позиции, так и идентичность всех каталитических остатков к протеистам mPPases3,9 и к разрешенной структуре Vigna radiata10 mPPase. Доступные структуры TmPPase в различных конформациях также полезны для эксперимента по проектированию лекарств на основе структуры (как виртуальный скрининг и de novo design).
Здесь мы сообщаем подробный протокол для скрининга ингибиторов TmPPase в формате 96 хорошо пластины (Рисунок 1). Протокол основан на колоритном методе молибдена голубой реакции, который был впервые разработан Fiske и Subbarow11. Этот метод включает в себя образование 12-фофофомолибдовой кислоты из ортофосфата и молибдата в кислых условиях, которая затем уменьшается, чтобы дать характерные синего цвета фофофомолибдин видов12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы сообщаем подробный протокол для простого скрининга ингибиторов для мембранной пирофосфатазы от T. maritima в 96 хорошо пластины форматна на основе Vidilaseris и др.14. Этот протокол недорог и основан на 12-фофофофлибдной кислоте, которая образуется из ортофосфата и молибд…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами от Фонда Джейн и Аатоса Эркко и BBSRC (BB/M021610) Адриану Голдману, Финляндская академия (No 308105) Кени Видилазерису (No 310297) Анри Хаарду и (No 265481) Яри Или-Каухалуоме, а Исследовательский фонд Хельсинкского университета – Густаву Бойе аф Геннесу. Авторы благодарят Бернадетт Гель за техническую помощь во время проекта.
Materials
| Adhesive sealing sheet | Thermo Scientific | AB0558 | |
| Ammonium heptamolybdate tetrahydrate | Merck | F1412481 636 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | 95212-250G | |
| BioLite 96Well Multidish | Thermo Scientific | 130188 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Merck | 1167431000 | |
| 8-well PCR Tube Strips 0.2 ml without caps (120) | Nippon genetics | FG-028 | |
| Dodecyl maltoside (DDM) | Melford | B2010-100G | |
| Ethanol | Merck | 1009901001 | |
| Glacial acetic acid | Merck | 1000631011 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | |
| Imidodiphosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | I0631-1G | |
| L-α-Phosphatidyl choline from soybean lecithin | Sigma | 429415-100GM | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 8147330500 | |
| Multiplate 96-Well PCR Plates | Bio-Rad | MLL9651 | |
| MultiSkan Go | Thermo Scientific | 10680879 | |
| Nepheloskan Ascent (Type 750) | Labsystems | ||
| Polystyrene Petri dish (size 150 mm x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5981-100EA | |
| Potassium chloride | Merck | 104936 | |
| Prism 6 software | GraphPad | ||
| QBT2 Heating block | Grant Instruments | ||
| Sodium meta-arsenite | Fisher Chemical | 12897692 | |
| Sodium phosphate dibasic (Pi) | Sigma | S0876-1KG | |
| Sodium pyrophosphate dibasic | Fluka | 71501-100G | |
| Trisodium citrate dihydrate | Fluka | 71404-1KG |
References
- Terstappen, G. C., Reggiani, A. In silico research in drug discovery. Trends in Pharmacological Sciences. 22 (1), 23-26 (2001).
- Rask-Andersen, M., Almen, M. S., Schioth, H. B. Trends in the exploitation of novel drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (8), 579-590 (2011).
- Shah, N. R., Vidilaseris, K., Xhaard, H., Goldman, A. Integral membrane pyrophosphatases: a novel drug target for human pathogens. AIMS Biophysics. 3 (1), 171-194 (2016).
- Baykov, A. A., Malinen, A. M., Luoto, H. H., Lahti, R. Pyrophosphate-Fueled Na+ and H+ Transport in Prokaryotes. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 77 (2), 267-276 (2013).
- Serrano, A., Perez-Castineira, J. R., Baltscheffsky, M., Baltscheffsky, H. H+-PPases: yesterday, today and tomorrow. IUBMB Life. 59 (2), 76-83 (2007).
- Liu, J., et al. A vacuolar-H+-pyrophosphatase (TgVP1) is required for microneme secretion, host cell invasion, and extracellular survival of Toxoplasma gondii. Molecular Microbiology. 93 (4), 698-712 (2014).
- Lemercier, G., et al. A pyrophosphatase regulating polyphosphate metabolism in acidocalcisomes is essential for Trypanosoma brucei virulence in mice. Journal of Biological Chemistry. 279 (5), 3420-3425 (2004).
- Belogurov, G. A., et al. Membrane-bound pyrophosphatase of Thermotoga maritima requires sodium for activity. Biochemistry. 44 (6), 2088-2096 (2005).
- Vidilaseris, K., et al. Asymmetry in catalysis by Thermotoga maritima membrane-bound pyrophosphatase demonstrated by a nonphosphorus allosteric inhibitor. Science Advances. 5 (5), (2019).
- Lin, S. M., et al. Crystal structure of a membrane-embedded H+-translocating pyrophosphatase. Nature. 484 (7394), 399-403 (2012).
- Fiske, C. H., Subbarow, Y. The colorimetric determination of phosphorus. Journal of Biological Chemistry. 66 (2), 375-400 (1925).
- Nagul, E. A., McKelvie, I. D., Worsfold, P., Kolev, S. D. The molybdenum blue reaction for the determination of orthophosphate revisited: Opening the black box. Analytica Chimica Acta. 890, 60-82 (2015).
- Kellosalo, J., Kajander, T., Palmgren, M. G., Lopez-Marques, R. L., Goldman, A. Heterologous expression and purification of membrane-bound pyrophosphatases. Protein Expression and Purification. 79 (1), 25-34 (2011).
- Vidilaseris, K., Kellosalo, J., Goldman, A. A high-throughput method for orthophosphate determination of thermostable membrane-bound pyrophosphatase activity. Analytical Methods. 10 (6), 646-651 (2018).
- He, Z. Q., Honeycutt, C. W. A modified molybdenum blue method for orthophosphate determination suitable for investigating enzymatic hydrolysis of organic phosphates. Communications in Soil Science and Plant Analysis. 36 (9-10), 1373-1383 (2005).
- Martin, B., Pallen, C. J., Wang, J. H., Graves, D. J. Use of fluorinated tyrosine phosphates to probe the substrate specificity of the low molecular weight phosphatase activity of calcineurin. Journal of Biological Chemistry. 260 (28), 14932-14937 (1985).
- Strauss, J., Wilkinson, C., Vidilaseris, K., Harborne, S. P. D., Goldman, A. A simple strategy to determine the dependence of membrane-bound pyrophosphatases on K+ as a cofactor. Methods in Enzymology. 607, 131-156 (2018).
