Здесь мы представляем метод скрининга для мембранной связаны пирофосфатазы (от Thermotoga maritima) ингибиторы на основе молибдена синяя реакция в 96 хорошо пластины формате.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Скрининг для Термотога маритима Мембрана-Связанные пирофосфаза ингибиторы
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Мембрана связаны пирофосфазазов (mPPases) являются димерические ферменты, которые встречаются в бактериях, археях, растений и протист паразитов. Эти белки расщепивают пирофосфат на две молекулы ортофосфата, которые соединяют с протоном и/или ионом натрия, перекачивающимися по мембране. Поскольку никаких гомологических белков не происходит у животных и людей, mPPases являются хорошими кандидатами в разработке потенциальных целей наркотиков. Здесь мы представляем подробный протокол для проверки ингибиторов mPPase с использованием молибдена синяя реакция в 96 хорошо пластины системы. Мы используем mPPase из термофильной бактерии Thermotoga maritima (TmPPase) в качестве образцового фермента. Этот протокол прост и недорог, что дает стабильный и надежный результат. Завершение протокола оценки активности занимает всего около часа с начала ассеидов до измерения абсорбции. Так как синий цвет, произведенный в этом анализе, стабилен в течение длительного периода времени, последующий анализ (ы) может быть выполнен сразу после предыдущей партии, а абсорбция может быть измерена позже для всех партий сразу. Недостатком этого протокола является то, что это делается вручную и, таким образом, может быть утомительным, а также требуют хороших навыков пайпеттинга и хранения времени. Кроме того, раствор арсенита,цитрата, используемый в этом ассее, содержит арсенит натрия, который является токсичным и должен быть обработан с необходимыми мерами предосторожности.
Введение
Приблизительно 25% от общего количества клеточных белков являются мембранными белками и около 60% из них являются лекарственными целями1,2. Одной из потенциальных целей препарата3, мембранно-связанных пирофосфатазы (mPPases), являются димерические ферменты, которые перекачивают протон и / или ион натрия через мембрану путем гидролизза пирофосфата в два ортофосфата4. mPPases можно найти в различных организмах5, таких как бактерии, археи, растения и протеистовые паразиты, за исключением людей и животных4. В протеист п....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Препарат протеина
ПРИМЕЧАНИЕ: Выражение и очищение TmPPase было описано в другом месте13.
- Приготовьте 10 мл буферного раствора реактивации, содержащего 20 мМ2-(N-морфолино)этанесульфоновая кислота (MES) pH 6.5, 3.5% (v/v) глицерол, 2 мМ дитиотрейтол (DTT), и 0,05% dodecyl maltoside (DDM).
- Приготовьте 10 мл реакционной смеси, содержащей 200 мм Tris-Cl pH 8.0, 8.0 mM MgCl2, 333 мМ KCl, и 67 мм NaCl.
ПРИМЕЧАНИЕ: Mg2 "требуется, чтобы хелат пирофосфат, как субстрат mPPase, Kq требуется для увеличения активности фермента, как TmPPase является калий зависи....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
В этом протоколе, восемь соединений (рисунок 2A ) были протестированы(Рисунок 2A) вместе с ВПЛ, общим ингибитором пирофосфатаз, в качестве положительного контроля. Каждое соединение было протестировано в трех различных концентрациях (1 МКм, 5 мкм и 20 мкм) в тройном. Рабочий процесс скрининга изображен на рисунке 1,начиная с подготовки образца и реагента до измерения абсорбции на уровне 860 нм.
В конце этого протокола, после добавлени.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Здесь мы сообщаем подробный протокол для простого скрининга ингибиторов для мембранной пирофосфатазы от T. maritima в 96 хорошо пластины форматна на основе Vidilaseris и др.14. Этот протокол недорог и основан на 12-фофофофлибдной кислоте, которая образуется из ортофосфата и молибдата в кислых условиях и сводится к фофофомолибдному виду с отчетливым синим цветом12. Этот метод является предпочтительным по сравнению с другими протоколами, такими как более чувствительн.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантами от Фонда Джейн и Аатоса Эркко и BBSRC (BB/M021610) Адриану Голдману, Финляндская академия (No 308105) Кени Видилазерису (No 310297) Анри Хаарду и (No 265481) Яри Или-Каухалуоме, а Исследовательский фонд Хельсинкского университета - Густаву Бойе аф Геннесу. Авторы благодарят Бернадетт Гель за техническую помощь во время проекта.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Клейкая уплотнительная пленка | Thermo Scientific | AB0558 | |
| Гептамолибдат аммония тетрагидрат | Merck | F1412481 636 | |
| Аскорбиновая кислота | Sigma-Aldrich | 95212-250G | |
| BioLite 96Well Multidish | Thermo Scientific | 130188 | |
| диметилсульфоксид (ДМСО) | Merck | 1167431000 | |
| 8-луночные полоски для ПЦР 0,2 мл без колпачков (120) | Nippon genetics | FG-028 | |
| Додецилмальтозид (ДДМ) | Melford | B2010-100G Этанол | |
| Merck | 1009901001 | ||
| соляная кислота | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | |
| Имидодифосфат натрия соль | Sigma-Aldrich | I0631-1G | |
| L-α-Фосфатидилхолин из соевого лецитина | Sigma | 429415-100GM | |
| Хлорид магния | Sigma-Aldrich | 8147330500 | |
| Multiplate 96-луночные ПЦР-планшеты | Bio-Rad | MLL9651 | |
| MultiSkan Go | Thermo Scientific | 10680879 | |
| Nepheloskan Подъем (тип 750) | Чашка Петри | ||
| (размер 150 мм х 15 мм) | Sigma-Aldrich | P5981-100EA | |
| Хлорид калия | Merck | 104936 | |
| программное обеспечение Prism 6 GraphPad | |||
| QBT2 Нагревательный блок | Grant Instruments | ||
| метаарсенит натрия | Fisher Chemical | ||
| Натрия фосфат двухосновной (Pi) | Sigma | S0876-1KG | |
| Пирофосфат натрия двухосновной | Fluka | 71501-100G | |
| Тринатрия цитрат дигидрат | Fluka | 71404-1KG |
Ссылки
- Terstappen, G. C., Reggiani, A. In silico research in drug discovery. Trends in Pharmacological Sciences. 22 (1), 23-26 (2001).
- Rask-Andersen, M., Almen, M. S., Schioth, H. B. Trends in the exploitation of novel drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (8),....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
