Screening for Thermotoga Maritima membran bundne Pyrophosphatase hemmere
Summary
Her presenterer vi en screening metode for membran-bundet pyrophosphatase (fra Thermotoga Maritima) hemmere basert på molybden blå reaksjonen i en 96 brønn plateformat.
Abstract
Membran-bundet pyrophosphatases (mPPases) er dimeric enzymer som forekommer i bakterier, Archaea, planter, og protist parasitter. Disse proteinene Cleave geranylpyrofosfat i to ortofosfat molekyler, som er kombinert med proton og/eller natrium ion pumpe over membranen. Siden ingen homologe proteiner forekommer hos dyr og mennesker, mPPases er gode kandidater i utformingen av potensielle narkotika mål. Her presenterer vi en detaljert protokoll til skjermen for mPPase-hemmere utnytte molybden blå reaksjonen i en 96 brønn plate system. Vi bruker mPPase fra varmekjære bakterien Thermotoga Maritima (TmPPase) som en modell enzym. Denne protokollen er enkel og rimelig, og produserer et konsistent og robust resultat. Det tar bare en time å fullføre aktiviteten analysen protokollen fra starten av analysen til absorbansen måling. Siden den blå fargen som produseres i denne analysen er stabil i lang tid, etterfølgende analysen (e) kan utføres umiddelbart etter forrige batch, og absorbansen kan måles senere for alle partier på en gang. Ulempen med denne protokollen er at det er gjort manuelt, og dermed kan være utmattende, samt kreve gode ferdigheter av pipettering og tid å holde. Videre, den arsenite-citrate løsning som brukes i denne analysen inneholder natrium arsenite, som er giftig og bør håndteres med nødvendige forholdsregler.
Introduction
Omtrent 25% av den totale cellulære proteiner er membran proteiner og ca 60% av dem er narkotika mål1,2. En av de potensielle stoffet mål3, membran-bundet Pyrophosphatases (mPPases), er dimeric enzymer som pumper proton og/eller natrium ion over membranen ved hydrolyse av geranylpyrofosfat i to orthophosphates4. mPPases kan finnes i ulike organismer5 som bakterier, Archaea, planter og protist parasitter, med unntak av mennesker og dyr4. I protist parasitter, for eksempel Plasmodium falciparum, Toxoplasma gondii og Trypanosoma brucei, mPPases er avgjørende for parasitten virulens6 og knockout av dette uttrykket i parasitter føre til svikt i å opprettholde intracellulære pH ved eksponering til den eksterne grunnleggende pH7. På grunn av deres viktighet og mangel på homologe protein tilstede i virveldyr, kan mPPases betraktes som potensielle narkotika mål for protistal sykdommer3.
Den in vitro screening av mPPase-hemmere i dette arbeidet er basert på en TmPPase modell system. TmPPase er et natrium ion pumping og kalium ion avhengig mPPase fra T. Maritima og har sin optimale aktivitet på 71 ° c8. Fordelene med dette enzymet er for eksempel dens lette i produksjon og rensing, god termisk stabilitet og høy spesifikk aktivitet. TmPPase viser både høy likhet i tillegg til fullstendig bevaring av stillingen samt identiteten til alle katalysatorer tilprotist mPPases og til den løste strukturen i Vigna radiata10 mPPase. De tilgjengelige strukturene i TmPPase i ulike konformasjonen er også nyttige for struktur BAS ert narkotika design eksperiment (som virtuell screening og de Novo design).
Her rapporterer vi en detaljert protokoll for screening av TmPPase-hemmere i en 96 brønn plateformat (figur 1). Protokollen er basert på fargemetrisk metoden for molybden blå reaksjon, som først ble utviklet av fiske og Subbarow11. Denne metoden innebærer dannelse av 12-phosphomolybdic syre fra ortofosfat og molybdat under Sure forhold, som deretter reduseres for å gi karakteristiske blå-fargede phosphomolybdenum arter12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her rapporterer vi en detaljert protokoll for enkel screening av hemmere for membran-bundet pyrophosphatase fra T. Maritima i en 96 brønn plateformat basert på Vidilaseris et al.14. Denne protokollen er billig og basert på 12-phosphomolybdic syre, som dannes fra ortofosfat og molybdat under Sure forhold og redusert til phosphomolybdenum arter med en distinkt blå farge12. Denne metoden foretrekkes fremfor andre protokoller, for eksempel mer følsom malakitt grø…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Jane og langgong Erkko Foundation og BBSRC (BB/M021610) til Adrian Goldman, Academy of Finland (nr. 308105) til Keni Vidilaseris, (nr. 310297) til Henri Xhaard, og (nr. 265481) til Jari Yli-Kauhaluoma, og Universitetet i Helsingfors Forskningsfond til Gustav Boije AF Gennäs. Forfatterne takker Bernadette Gehl for sin tekniske hjelp i løpet av prosjektet.
Materials
| Adhesive sealing sheet | Thermo Scientific | AB0558 | |
| Ammonium heptamolybdate tetrahydrate | Merck | F1412481 636 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | 95212-250G | |
| BioLite 96Well Multidish | Thermo Scientific | 130188 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Merck | 1167431000 | |
| 8-well PCR Tube Strips 0.2 ml without caps (120) | Nippon genetics | FG-028 | |
| Dodecyl maltoside (DDM) | Melford | B2010-100G | |
| Ethanol | Merck | 1009901001 | |
| Glacial acetic acid | Merck | 1000631011 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | |
| Imidodiphosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | I0631-1G | |
| L-α-Phosphatidyl choline from soybean lecithin | Sigma | 429415-100GM | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 8147330500 | |
| Multiplate 96-Well PCR Plates | Bio-Rad | MLL9651 | |
| MultiSkan Go | Thermo Scientific | 10680879 | |
| Nepheloskan Ascent (Type 750) | Labsystems | ||
| Polystyrene Petri dish (size 150 mm x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5981-100EA | |
| Potassium chloride | Merck | 104936 | |
| Prism 6 software | GraphPad | ||
| QBT2 Heating block | Grant Instruments | ||
| Sodium meta-arsenite | Fisher Chemical | 12897692 | |
| Sodium phosphate dibasic (Pi) | Sigma | S0876-1KG | |
| Sodium pyrophosphate dibasic | Fluka | 71501-100G | |
| Trisodium citrate dihydrate | Fluka | 71404-1KG |
References
- Terstappen, G. C., Reggiani, A. In silico research in drug discovery. Trends in Pharmacological Sciences. 22 (1), 23-26 (2001).
- Rask-Andersen, M., Almen, M. S., Schioth, H. B. Trends in the exploitation of novel drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (8), 579-590 (2011).
- Shah, N. R., Vidilaseris, K., Xhaard, H., Goldman, A. Integral membrane pyrophosphatases: a novel drug target for human pathogens. AIMS Biophysics. 3 (1), 171-194 (2016).
- Baykov, A. A., Malinen, A. M., Luoto, H. H., Lahti, R. Pyrophosphate-Fueled Na+ and H+ Transport in Prokaryotes. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 77 (2), 267-276 (2013).
- Serrano, A., Perez-Castineira, J. R., Baltscheffsky, M., Baltscheffsky, H. H+-PPases: yesterday, today and tomorrow. IUBMB Life. 59 (2), 76-83 (2007).
- Liu, J., et al. A vacuolar-H+-pyrophosphatase (TgVP1) is required for microneme secretion, host cell invasion, and extracellular survival of Toxoplasma gondii. Molecular Microbiology. 93 (4), 698-712 (2014).
- Lemercier, G., et al. A pyrophosphatase regulating polyphosphate metabolism in acidocalcisomes is essential for Trypanosoma brucei virulence in mice. Journal of Biological Chemistry. 279 (5), 3420-3425 (2004).
- Belogurov, G. A., et al. Membrane-bound pyrophosphatase of Thermotoga maritima requires sodium for activity. Biochemistry. 44 (6), 2088-2096 (2005).
- Vidilaseris, K., et al. Asymmetry in catalysis by Thermotoga maritima membrane-bound pyrophosphatase demonstrated by a nonphosphorus allosteric inhibitor. Science Advances. 5 (5), (2019).
- Lin, S. M., et al. Crystal structure of a membrane-embedded H+-translocating pyrophosphatase. Nature. 484 (7394), 399-403 (2012).
- Fiske, C. H., Subbarow, Y. The colorimetric determination of phosphorus. Journal of Biological Chemistry. 66 (2), 375-400 (1925).
- Nagul, E. A., McKelvie, I. D., Worsfold, P., Kolev, S. D. The molybdenum blue reaction for the determination of orthophosphate revisited: Opening the black box. Analytica Chimica Acta. 890, 60-82 (2015).
- Kellosalo, J., Kajander, T., Palmgren, M. G., Lopez-Marques, R. L., Goldman, A. Heterologous expression and purification of membrane-bound pyrophosphatases. Protein Expression and Purification. 79 (1), 25-34 (2011).
- Vidilaseris, K., Kellosalo, J., Goldman, A. A high-throughput method for orthophosphate determination of thermostable membrane-bound pyrophosphatase activity. Analytical Methods. 10 (6), 646-651 (2018).
- He, Z. Q., Honeycutt, C. W. A modified molybdenum blue method for orthophosphate determination suitable for investigating enzymatic hydrolysis of organic phosphates. Communications in Soil Science and Plant Analysis. 36 (9-10), 1373-1383 (2005).
- Martin, B., Pallen, C. J., Wang, J. H., Graves, D. J. Use of fluorinated tyrosine phosphates to probe the substrate specificity of the low molecular weight phosphatase activity of calcineurin. Journal of Biological Chemistry. 260 (28), 14932-14937 (1985).
- Strauss, J., Wilkinson, C., Vidilaseris, K., Harborne, S. P. D., Goldman, A. A simple strategy to determine the dependence of membrane-bound pyrophosphatases on K+ as a cofactor. Methods in Enzymology. 607, 131-156 (2018).
