تحليل السكان الجانبية في خطوط الخلايا السرطانية الصلبة
Summary
يتم تقديم طريقة مريحة وسريعة وفعالة من حيث التكلفة لقياس نسبة الخلايا السكانية الجانبية في خطوط خلايا الورم الصلبة.
Abstract
الخلايا الجذعية السرطانية (CSCs) هي سبب مهم لنمو الورم، والانبثاث، وتكرار. عزل وتحديد CSCs ذات أهمية كبيرة لأبحاث الأورام. حاليا، وتستخدم عدة تقنيات لتحديد وتنقية CSCs من الأنسجة السرطانية وخطوط الخلايا السرطانية. فصل وتحليل خلايا السكان الجانبية (SP) هما من الطرق الشائعة الاستخدام. تعتمد الأساليب على قدرة CSCs على طرد الأصباغ الفلورية بسرعة ، مثل Hoechst 33342. ويرتبط efflux من الصبغة مع ناقلات كاسيت ATP ملزمة (ABC) ويمكن أن تمنعها مثبطات الناقل ABC. يتم وصف طرق تلطيخ الخلايا السرطانية المستزرعة مع Hoechst 33342 وتحليل نسبة خلايا SP الخاصة بهم عن طريق قياس التدفق الخلوي. هذا المقايسة مريحة وسريعة وفعالة من حيث التكلفة. يمكن أن تساهم البيانات التي تم إنشاؤها في هذا الفحص في فهم أفضل لتأثير الجينات أو الإشارات الأخرى خارج الخلية وداخل الخلايا على خصائص الجذعية للخلايا السرطانية.
Introduction
الخلايا الجذعية السرطانية (CSCs) هي مجموعات فرعية من الخلايا ذات القدرة على التجديد الذاتي وإمكانات التمايز المتعددة ، والتي تلعب دورا حيويا في نمو الورم ، والانبثاث ، وتكرار1،2. حاليا، تم تحديد CSCs أن تكون موجودة في مجموعة متنوعة من الأورام الخبيثة، بما في ذلك الرئة والدماغ والبنكرياس والبروستاتا والثدي وسرطان الكبد3و4و5و6و7و8و9. ويستند تحديد CSCs في هذه الأورام أساسا على وجود البروتينات علامة السطح، مثل التعبير عالية و / أو منخفضة من CD44، CD24، CD133، وSca-19،10،ولكن لم يتم الإبلاغ عن علامة فريدة من نوعها التي يمكن أن تميز CSCs من غير CSCs حتى الآن. حاليا، يتم استخدام العديد من التقنيات لتحديد وتنقية CSCs في الأنسجة السرطانية أو خطوط الخلايا السرطانية. تم تصميم هذه التقنيات استنادا إلى خصائص محددة من CSCs. من بينها، المقايسات وفرز الخلايا الجانبية (SP) هي اثنين من الطرق الشائعة الاستخدام.
تم اكتشاف خلايا SP في الأصل من قبل Goodell وآخرون.11، عندما وصفت الخلايا الجذعية الدموية في خلايا نخاع العظم الماوس. عندما وصفت خلايا نخاع العظم الماوس مع صبغة الفلورسنت Hoechst 33342، ظهرت مجموعة صغيرة من الخلايا Hoechst 33342 ملطخة بشكل خافت في مؤامرة نقطة ثنائية الأبعاد من فحص قياس التدفق الخلوي. Hoechst 33342 هو صبغة الحمض النووي ملزمة ولها ما لا يقل عن وضعين ملزمة التي تؤدي إلى خصائص طيفية مختلفة. عند عرض انبعاث الفلورسينس على طولين موجيين في نفس الوقت ، يمكن الكشف عن مجموعات سكانية متعددة12. في المقايسة، كان متحمس Hoechst 33342 في 350 نانومتر، وقاست مضان باستخدام 450/20 نانومتر تمرير النطاق (BP) مرشح و675 نانومتر حافة مرشح تمريرة طويلة (EFLP)11. بالمقارنة مع مجموعة كاملة من خلايا نخاع العظام، تم إثراء هذه المجموعة من الخلايا مع الخلايا الجذعية الدموية تسمى خلايا SP11. خلايا SP قادرة على طرد Hoechst 33342 بسرعة. ويرتبط efflux من هذه الصبغة إلى ATP ملزمة كاسيت (ABC) الناقلات13, والتي يمكن أن تمنع من قبل بعض وكلاء مثل Fumitremorgin C14, فيراباميل وReserpine15,16. بعد ذلك ، تم الكشف عن نسب مختلفة من خلايا SP في مجموعة متنوعة من الأنسجة والأعضاء والأنسجة السرطانية وخطوط الخلايا السرطانية17و18و19. هذه الخلايا SP لها العديد من خصائص الخلايا الجذعية17،19.
تصف هذه المخطوطة هويشست 33342 وسم وتلطيخ الخلايا السرطانية المستزرعة وتحليل خلايا SP حسب قياس التدفق الخلوي. وعلاوة على ذلك، يتم عرض الأمثل للتركيز Hoechst 33342 واختيار مانع السليم لخط خلية ورم محددة باستخدام هذا النهج. وأخيرا، يتم إثبات آثار تعزيز الجذعية أو إشارات التثبيط على نسبة SP في الخلايا السرطانية. وتبين الأمثلة التجريبية أنه يمكن استخدام تحليل SP لاستكشاف آثار إشارات مختلفة، مثل التعبير الجيني، ومثبطات صغيرة، والمفعلات، والسيتوكينات، وchemkines، على جذع الورم. بالمقارنة مع الطرق الأخرى لعزل وتنقية CSCs ، مثل فرز CD44+/ CD24– السكان ، وتحليل ألدهيد ديهيدروجيناز (ALDH) ، وأجهزة قياس تكوين مجال الورم ، فإن هذه الطريقة أسهل للتلاعب وفعالة من حيث التكلفة.
Protocol
Representative Results
Discussion
هناك العديد من النقاط الرئيسية التي يجب وضعها في الاعتبار لإجراء فحص SP. الأول هو اختيار مانع مناسب، مثل فيراباميل أو ريسربين، لكل خط خلية، لأنه يتم تحديد موقع “بوابة” من خلايا SP وفقا للموضع الذي يختفي فيه عدد كبير من خلايا SP بعد إضافة مانع. لخط الخلية MDA-MB-231، Reserpine يعمل بشكل جيد. ومع ذلك، بالن?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد مولت هذا العمل مؤسسة العلوم الطبيعية الصينية 81572599 81773124 81972787؛ مؤسسة العلوم الطبيعية لمدينة تيانجين (الصين) 19JCYBJC27300؛ مستشفى تيانجين الشعبي وجامعة نانكاي منحة البحوث التعاونية 2016rmnk005; صناديق البحوث الأساسية للجامعات المركزية، جامعة نانكاي 63191153.
Materials
| 6 well cell culture plate | CORNING | 3516 | 9.5 cm2 (approx.) |
| Colivelin | MCE | HY-P1061A | Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries (BIOIND) | 04-001-1ACS | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD LSRFortessa | |
| Flow cytometer software | BD Biosciences | FACSDiva | |
| Flow cytometry analysis software | BD Biosciences | FlowJo | |
| Hoechst33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | bisBenzimide H 33342 trihydrochloride |
| Polystyrene round bottom test tube | CORNING | 352054 | 12 x 75 mm, 5mL |
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | 3,8-Diamino-5-[3-(diethylmethylammonio)propyl]-6-phenylphenanthridinium diiodide |
| Reserpine | Sigma-Aldrich | 83580 | (3β, 16β, 17α, 18β, 20α)-11,17-Dimethoxy-18-[(3,4,5-trimethoxybenzoyl)oxy]yohimban-16-carboxylic acid methyl ester |
| SKLB816 | Provided by Dr. Shengyong Yang, Sichuan University | ||
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200072 | |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | 5-[N-(3,4-Dimethoxyphenylethyl)methylamino]-2-(3,4-dimethoxyphenyl)-2-isopropylvaleronitrile hydrochloride |
References
- Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).
- Batlle, E., Clevers, H. Cancer stem cells revisited. Nature Medicine. 23 (10), 1124-1134 (2017).
- Eramo, A., et al. Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population. Cell Death & Differentiation. 15 (3), 504-514 (2008).
- Kahlert, U. D., et al. CD133/CD15 defines distinct cell subpopulations with differential in vitro clonogenic activity and stem cell-related gene expression profile in in vitro propagated glioblastoma multiforme-derived cell line with a PNET-like component. Folia Neuropathologica. 50 (4), 357-368 (2012).
- Bailey, J. M., et al. DCLK1 marks a morphologically distinct subpopulation of cells with stem cell properties in preinvasive pancreatic cancer. Gastroenterology. 146 (1), 245-256 (2014).
- Hurt, E. M., Kawasaki, B. T., Klarmann, G. J., Thomas, S. B., Farrar, W. L. CD44+ CD24(-) prostate cells are early cancer progenitor/stem cells that provide a model for patients with poor prognosis. British Journal of Cancer. 98 (4), 756-765 (2008).
- Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
- Yang, Z. F., et al. Significance of CD90+ cancer stem cells in human liver cancer. Cancer Cell. 13 (2), 153-166 (2008).
- Schulenburg, A., et al. Cancer stem cells in basic science and in translational oncology: can we translate into clinical application. Journal of Hematology & Oncolcology. 8, 16 (2015).
- Park, J. W., Park, J. M., Park, D. M., Kim, D. Y., Kim, H. K. Stem Cells Antigen-1 Enriches for a Cancer Stem Cell-Like Subpopulation in Mouse Gastric Cancer. Stem Cells. 34 (5), 1177-1187 (2016).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. Journal of Experimental Medicine. 183 (4), 1797-1806 (1996).
- Goodell, M. A. Stem cell identification and sorting using the Hoechst 33342 side population (SP). Current Protocols in Cytometry. , 18 (2005).
- Begicevic, R. R., Falasca, M. ABC Transporters in Cancer Stem Cells: Beyond Chemoresistance. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2362 (2017).
- Rabindran, S. K., Ross, D. D., Doyle, L. A., Yang, W., Greenberger, L. M. Fumitremorgin C reverses multidrug resistance in cells transfected with the breast cancer resistance protein. Cancer Research. 60 (1), 47-50 (2000).
- Takara, K., et al. Differential effects of calcium antagonists on ABCG2/BCRP-mediated drug resistance and transport in SN-38-resistant HeLa cells. Molecular Medicine Reports. 5 (3), 603-609 (2012).
- Matsson, P., Pedersen, J. M., Norinder, U., Bergstrom, C. A., Artursson, P. Identification of novel specific and general inhibitors of the three major human ATP-binding cassette transporters P-gp, BCRP and MRP2 among registered drugs. Pharmaceutical Research. 26 (8), 1816-1831 (2009).
- Challen, G. A., Little, M. H. A side order of stem cells: the SP phenotype. Stem Cells. 24 (1), 3-12 (2006).
- Wu, C., Alman, B. A. Side population cells in human cancers. Cancer Letters. 268 (1), 1-9 (2008).
- Patrawala, L., et al. Side population is enriched in tumorigenic, stem-like cancer cells, whereas ABCG2+ and ABCG2- cancer cells are similarly tumorigenic. Cancer Research. 65 (14), 6207-6219 (2005).
- Yamada, M., et al. Nasal Colivelin treatment ameliorates memory impairment related to Alzheimer’s disease. Neuropsychopharmacology. 33 (8), 2020-2032 (2008).
- Marotta, L. L., et al. The JAK2/STAT3 signaling pathway is required for growth of CD44(+)CD24(-) stem cell-like breast cancer cells in human tumors. Journal of Clinical Investigation. 121 (7), 2723-2735 (2011).
- Zhang, C. H., et al. From Lead to Drug Candidate: Optimization of 3-(Phenylethynyl)-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine Derivatives as Agents for the Treatment of Triple Negative Breast Cancer. Journal of Medicnal Chemistry. 59 (21), 9788-9805 (2016).
- Tam, W. L., et al. Protein kinase C alpha is a central signaling node and therapeutic target for breast cancer stem cells. Cancer Cell. 24 (3), 347-364 (2013).
- Ibrahim, S. F., Diercks, A. H., Petersen, T. W., van den Engh, G. Kinetic analyses as a critical parameter in defining the side population (SP) phenotype. Experimental Cell Research. 313 (9), 1921-1926 (2007).
- Petriz, J. Flow cytometry of the side population (SP). Current Protocol in Cytometry. , 23 (2013).
- Hiraga, T., Ito, S., Nakamura, H. Side population in MDA-MB-231 human breast cancer cells exhibits cancer stem cell-like properties without higher bone-metastatic potential. Oncology Reports. 25 (1), 289-296 (2011).
- Shen, W., et al. ICAM3 mediates inflammatory signaling to promote cancer cell stemness. Cancer Letters. 422, 29-43 (2018).
- Koh, S. Y., Moon, J. Y., Unno, T., Cho, S. K. Baicalein Suppresses Stem Cell-Like Characteristics in Radio- and Chemoresistant MDA-MB-231 Human Breast Cancer Cells through Up-Regulation of IFIT2. Nutrients. 11 (3), 624 (2019).
- Lee, H., Park, S., Kim, J. B., Kim, J., Kim, H. Entrapped doxorubicin nanoparticles for the treatment of metastatic anoikis-resistant cancer cells. Cancer Letters. 332 (1), 110-119 (2013).
- Ota, M., et al. ADAM23 is downregulated in side population and suppresses lung metastasis of lung carcinoma cells. Cancer Science. 107 (4), 433-443 (2016).
- Wei, H., et al. The mechanisms for lung cancer risk of PM2.5 : Induction of epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell properties in human non-small cell lung cancer cells. Environmental Toxicology. 32 (11), 2341-2351 (2017).
- Prasanphanich, A. F., White, D. E., Gran, M. A., Kemp, M. L. Kinetic Modeling of ABCG2 Transporter Heterogeneity: A Quantitative, Single-Cell Analysis of the Side Population Assay. PLoS Computational Biology. 12 (11), 1005188 (2016).
- Han, H., et al. An endogenous inhibitor of angiogenesis inversely correlates with side population phenotype and function in human lung cancer cells. Oncogene. 33 (9), 1198-1206 (2014).
- Loebinger, M. R., Sage, E. K., Davies, D., Janes, S. M. TRAIL-expressing mesenchymal stem cells kill the putative cancer stem cell population. British Journal of Cancer. 103 (11), 1692-1697 (2010).
- Chiba, T., et al. Side population purified from hepatocellular carcinoma cells harbors cancer stem cell-like properties. Hepatology. 44 (1), 240-251 (2006).
- Hirschmann-Jax, C., et al. A distinct “side population” of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 101 (39), 14228-14233 (2004).
- Chen, A. Y., Yu, C., Gatto, B., Liu, L. F. DNA minor groove-binding ligands: a different class of mammalian DNA topoisomerase I inhibitors. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 90 (17), 8131-8135 (1993).
