Analyse de la population latérale dans les variétés de cellule de tumeur solide
Summary
Une méthode pratique, rapide, et rentable pour mesurer la proportion de cellules de population latérale dans les variétés de cellule pleines de tumeur est présentée.
Abstract
Les cellules souches cancéreuses (CSC) sont une cause importante de croissance, de métastase, et de répétition de tumeur. L’isolement et l’identification de CSCs sont d’une grande importance pour la recherche de tumeur. Actuellement, plusieurs techniques sont utilisées pour l’identification et la purification des CSC à partir de tissus tumoraux et de lignées cellulaires tumorales. La séparation et l’analyse des cellules de la population latérale (SP) sont deux des méthodes couramment utilisées. Les méthodes reposent sur la capacité des CSC à expulser rapidement les colorants fluorescents, tels que Hoechst 33342. L’efflux du colorant est associé aux transporteurs de cassette de liaison à l’ATP (ABC) et peut être inhibé par des inhibiteurs du transporteur ABC. Des méthodes pour souter les cellules cultivées de tumeur avec Hoechst 33342 et analyser la proportion de leurs cellules de SP par cytometry d’écoulement sont décrites. Ce test est pratique, rapide et rentable. Les données générées dans ce test peuvent contribuer à une meilleure compréhension de l’effet des gènes ou d’autres signaux extracellulaires et intracellulaires sur les propriétés de stemness des cellules tumorales.
Introduction
Les cellules souches cancéreuses (CSC) sont des sous-ensembles de cellules ayant une capacité d’autore renouvellement et un potentiel de différenciation multiple, qui jouent un rôle essentiel dans la croissance tumorale, les métastases et la récurrence1,2. Actuellement, les CSC ont été identifiés comme existant dans une variété de tumeurs malignes, y compris les cancers du poumon, du cerveau, du pancréas, de la prostate, du sein et du foie3,4,5,6,7,8,9. L’identification de CSCs dans ces tumeurs est principalement basée sur la présence des protéines de marqueur de surface, telles que l’expression haute et/ou basse de CD44, CD24, CD133, etSca-1 9,10,mais un marqueur unique qui peut distinguer CSCs de non-CSCs n’a pas été rapporté jusqu’ici. Actuellement, plusieurs techniques sont employées pour identifier et purifier des CSC dans le tissu tumoral ou les variétés de cellule tumorales. Ces techniques sont conçues en fonction des propriétés spécifiques des CSC. Parmi eux, les tests et le tri des cellules de la population latérale (SP) sont deux des méthodes couramment utilisées.
Les cellules SP ont été découvertes à l’origine par Goodell et al.11,lorsqu’ils ont caractérisé les cellules souches hématopoïétiques dans les cellules de la moelle osseuse de la souris. Quand les cellules de moelle de souris ont été étiquetées avec le colorant fluorescent Hoechst 33342, un petit groupe de cellules de Hoechst 33342 faiblement-souillées est apparu dans le diagramme bidimensionnel de point d’une analyse cytometry d’écoulement. Hoechst 33342 est un colorant liant l’ADN et a au moins deux modes de liaison qui conduisent à des caractéristiques spectrales différentes. Lors de la visualisation de l’émission de fluorescence à deux longueurs d’onde en même temps, plusieurs populations peuvent être révélées12. Dans leur test, le Hoechst 33342 a été excité à 350 nm et la fluorescence a été mesurée à l’aide du filtre passe-bande (BP) de 450/20 nm et du filtre de bord de 675 nm passe-long (EFLP)11. Par rapport à toute la population de cellules de moelle osseuse, ce groupe de cellules a été enrichi en cellules souches hématopoïétiques appelées cellules SP11. Les cellules SP sont capables d’expulser rapidement Hoechst 33342. L’efflux de ce colorant est apparenté aux transporteurs de cassettes de liaison à l’ATP (ABC)13,qui peuvent être inhibés par certains agents tels que la fumitrémorgineC14,le vérapamil et la réserpine15,16. Après cela, différentes proportions de cellules SP ont été détectées dans une variété de tissus, d’organes, de tissus tumoraux et de lignées cellulairestumorales 17,18,19. Ces cellules SP présentent de nombreuses caractéristiques des cellules souches17,19.
Ce manuscrit décrit le étiquetage et la coloration de Hoechst 33342 des cellules tumorales cultivées et l’analyse des cellules SP par cytométrie en flux. D’ailleurs, l’optimisation de la concentration de Hoechst 33342 et la sélection appropriée de bloqueur pour une variété de cellule spécifique de tumeur utilisant cette approche sont montrées. Enfin, les effets des signaux de promotion ou d’inhibition de stemness sur la proportion de SP dans les cellules tumorales sont démontrés. Les exemples expérimentaux démontrent que l’analyse du SP peut être employée pour explorer les effets de divers signaux, tels que l’expression de gène, les petits inhibiteurs, les activateurs, les cytokines, et les chemokines, sur le stemness de tumeur. Par rapport à d’autres méthodes d’isolement et de purification des CSC, telles que le tri de cd44+/CD24– population, l’analyse de l’aldéhyde déshydrogénase (ALDH) et les tests de formation de sphère tumorale, cette méthode est plus facile à manipuler et est rentable.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il y a plusieurs points clés à garder à l’esprit pour le test SP. Le premier est la sélection d’un bloqueur approprié, tel que Vérapamil ou Réserpine, pour chaque lignée cellulaire, car l’emplacement « porte » des cellules SP est déterminé en fonction de la position à laquelle un grand nombre de cellules SP disparaissent après l’ajout du bloqueur. Pour la lignée cellulaire MDA-MB-231, Reserpine fonctionne bien. Cependant, pour d’autres lignées cellulaires, différents bloqueurs peuvent mieux f…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par la Natural Science Foundation of China 81572599, 81773124 et 81972787; Natural Science Foundation of Tianjin City (China) 19JCYBJC27300; Tianjin People’s Hospital &Nankai University Collaborative Research Grant 2016rmnk005; Fonds de recherche fondamentale pour les universités centrales, Université de Nankai 63191153.
Materials
| 6 well cell culture plate | CORNING | 3516 | 9.5 cm2 (approx.) |
| Colivelin | MCE | HY-P1061A | Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries (BIOIND) | 04-001-1ACS | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD LSRFortessa | |
| Flow cytometer software | BD Biosciences | FACSDiva | |
| Flow cytometry analysis software | BD Biosciences | FlowJo | |
| Hoechst33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | bisBenzimide H 33342 trihydrochloride |
| Polystyrene round bottom test tube | CORNING | 352054 | 12 x 75 mm, 5mL |
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | 3,8-Diamino-5-[3-(diethylmethylammonio)propyl]-6-phenylphenanthridinium diiodide |
| Reserpine | Sigma-Aldrich | 83580 | (3β, 16β, 17α, 18β, 20α)-11,17-Dimethoxy-18-[(3,4,5-trimethoxybenzoyl)oxy]yohimban-16-carboxylic acid methyl ester |
| SKLB816 | Provided by Dr. Shengyong Yang, Sichuan University | ||
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200072 | |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | 5-[N-(3,4-Dimethoxyphenylethyl)methylamino]-2-(3,4-dimethoxyphenyl)-2-isopropylvaleronitrile hydrochloride |
References
- Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).
- Batlle, E., Clevers, H. Cancer stem cells revisited. Nature Medicine. 23 (10), 1124-1134 (2017).
- Eramo, A., et al. Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population. Cell Death & Differentiation. 15 (3), 504-514 (2008).
- Kahlert, U. D., et al. CD133/CD15 defines distinct cell subpopulations with differential in vitro clonogenic activity and stem cell-related gene expression profile in in vitro propagated glioblastoma multiforme-derived cell line with a PNET-like component. Folia Neuropathologica. 50 (4), 357-368 (2012).
- Bailey, J. M., et al. DCLK1 marks a morphologically distinct subpopulation of cells with stem cell properties in preinvasive pancreatic cancer. Gastroenterology. 146 (1), 245-256 (2014).
- Hurt, E. M., Kawasaki, B. T., Klarmann, G. J., Thomas, S. B., Farrar, W. L. CD44+ CD24(-) prostate cells are early cancer progenitor/stem cells that provide a model for patients with poor prognosis. British Journal of Cancer. 98 (4), 756-765 (2008).
- Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
- Yang, Z. F., et al. Significance of CD90+ cancer stem cells in human liver cancer. Cancer Cell. 13 (2), 153-166 (2008).
- Schulenburg, A., et al. Cancer stem cells in basic science and in translational oncology: can we translate into clinical application. Journal of Hematology & Oncolcology. 8, 16 (2015).
- Park, J. W., Park, J. M., Park, D. M., Kim, D. Y., Kim, H. K. Stem Cells Antigen-1 Enriches for a Cancer Stem Cell-Like Subpopulation in Mouse Gastric Cancer. Stem Cells. 34 (5), 1177-1187 (2016).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. Journal of Experimental Medicine. 183 (4), 1797-1806 (1996).
- Goodell, M. A. Stem cell identification and sorting using the Hoechst 33342 side population (SP). Current Protocols in Cytometry. , 18 (2005).
- Begicevic, R. R., Falasca, M. ABC Transporters in Cancer Stem Cells: Beyond Chemoresistance. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2362 (2017).
- Rabindran, S. K., Ross, D. D., Doyle, L. A., Yang, W., Greenberger, L. M. Fumitremorgin C reverses multidrug resistance in cells transfected with the breast cancer resistance protein. Cancer Research. 60 (1), 47-50 (2000).
- Takara, K., et al. Differential effects of calcium antagonists on ABCG2/BCRP-mediated drug resistance and transport in SN-38-resistant HeLa cells. Molecular Medicine Reports. 5 (3), 603-609 (2012).
- Matsson, P., Pedersen, J. M., Norinder, U., Bergstrom, C. A., Artursson, P. Identification of novel specific and general inhibitors of the three major human ATP-binding cassette transporters P-gp, BCRP and MRP2 among registered drugs. Pharmaceutical Research. 26 (8), 1816-1831 (2009).
- Challen, G. A., Little, M. H. A side order of stem cells: the SP phenotype. Stem Cells. 24 (1), 3-12 (2006).
- Wu, C., Alman, B. A. Side population cells in human cancers. Cancer Letters. 268 (1), 1-9 (2008).
- Patrawala, L., et al. Side population is enriched in tumorigenic, stem-like cancer cells, whereas ABCG2+ and ABCG2- cancer cells are similarly tumorigenic. Cancer Research. 65 (14), 6207-6219 (2005).
- Yamada, M., et al. Nasal Colivelin treatment ameliorates memory impairment related to Alzheimer’s disease. Neuropsychopharmacology. 33 (8), 2020-2032 (2008).
- Marotta, L. L., et al. The JAK2/STAT3 signaling pathway is required for growth of CD44(+)CD24(-) stem cell-like breast cancer cells in human tumors. Journal of Clinical Investigation. 121 (7), 2723-2735 (2011).
- Zhang, C. H., et al. From Lead to Drug Candidate: Optimization of 3-(Phenylethynyl)-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine Derivatives as Agents for the Treatment of Triple Negative Breast Cancer. Journal of Medicnal Chemistry. 59 (21), 9788-9805 (2016).
- Tam, W. L., et al. Protein kinase C alpha is a central signaling node and therapeutic target for breast cancer stem cells. Cancer Cell. 24 (3), 347-364 (2013).
- Ibrahim, S. F., Diercks, A. H., Petersen, T. W., van den Engh, G. Kinetic analyses as a critical parameter in defining the side population (SP) phenotype. Experimental Cell Research. 313 (9), 1921-1926 (2007).
- Petriz, J. Flow cytometry of the side population (SP). Current Protocol in Cytometry. , 23 (2013).
- Hiraga, T., Ito, S., Nakamura, H. Side population in MDA-MB-231 human breast cancer cells exhibits cancer stem cell-like properties without higher bone-metastatic potential. Oncology Reports. 25 (1), 289-296 (2011).
- Shen, W., et al. ICAM3 mediates inflammatory signaling to promote cancer cell stemness. Cancer Letters. 422, 29-43 (2018).
- Koh, S. Y., Moon, J. Y., Unno, T., Cho, S. K. Baicalein Suppresses Stem Cell-Like Characteristics in Radio- and Chemoresistant MDA-MB-231 Human Breast Cancer Cells through Up-Regulation of IFIT2. Nutrients. 11 (3), 624 (2019).
- Lee, H., Park, S., Kim, J. B., Kim, J., Kim, H. Entrapped doxorubicin nanoparticles for the treatment of metastatic anoikis-resistant cancer cells. Cancer Letters. 332 (1), 110-119 (2013).
- Ota, M., et al. ADAM23 is downregulated in side population and suppresses lung metastasis of lung carcinoma cells. Cancer Science. 107 (4), 433-443 (2016).
- Wei, H., et al. The mechanisms for lung cancer risk of PM2.5 : Induction of epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell properties in human non-small cell lung cancer cells. Environmental Toxicology. 32 (11), 2341-2351 (2017).
- Prasanphanich, A. F., White, D. E., Gran, M. A., Kemp, M. L. Kinetic Modeling of ABCG2 Transporter Heterogeneity: A Quantitative, Single-Cell Analysis of the Side Population Assay. PLoS Computational Biology. 12 (11), 1005188 (2016).
- Han, H., et al. An endogenous inhibitor of angiogenesis inversely correlates with side population phenotype and function in human lung cancer cells. Oncogene. 33 (9), 1198-1206 (2014).
- Loebinger, M. R., Sage, E. K., Davies, D., Janes, S. M. TRAIL-expressing mesenchymal stem cells kill the putative cancer stem cell population. British Journal of Cancer. 103 (11), 1692-1697 (2010).
- Chiba, T., et al. Side population purified from hepatocellular carcinoma cells harbors cancer stem cell-like properties. Hepatology. 44 (1), 240-251 (2006).
- Hirschmann-Jax, C., et al. A distinct “side population” of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 101 (39), 14228-14233 (2004).
- Chen, A. Y., Yu, C., Gatto, B., Liu, L. F. DNA minor groove-binding ligands: a different class of mammalian DNA topoisomerase I inhibitors. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 90 (17), 8131-8135 (1993).
