Análise da população lateral em linhas celulares tumorais sólidas
Summary
Um método conveniente, rápido e econômico para medir a proporção de células da população lateral em linhas de células tumorais sólidas é apresentado.
Abstract
As células-tronco cancerígenas (CSCs) são uma importante causa de crescimento tumoral, metástase e recidiva. O isolamento e identificação dos CSCs são de grande importância para a pesquisa de tumores. Atualmente, diversas técnicas são utilizadas para a identificação e purificação de CSCs a partir de tecidos tumorais e linhas de células tumorais. A separação e análise das células da população lateral (SP) são dois dos métodos comumente utilizados. Os métodos dependem da capacidade dos CSCs de expulsar rapidamente corantes fluorescentes, como hoechst 33342. O efflux do corante está associado aos transportadores de de ligação ATP (ABC) e pode ser inibido pelos inibidores do transporte ABC. Métodos para coloração de células tumorais cultivadas com Hoechst 33342 e análise da proporção de suas células de SP por citometria de fluxo são descritos. Este ensaio é conveniente, rápido e econômico. Os dados gerados neste ensaio podem contribuir para uma melhor compreensão do efeito dos genes ou outros sinais extracelulares e intracelulares nas propriedades de tronco das células tumorais.
Introduction
As células-tronco cancerígenas (CSCs) são subconjuntos de células com capacidade de autoconexão e potencial de diferenciação múltipla, que desempenham um papel vital no crescimento do tumor, metástase e recidiva1,2. Atualmente, os CSCs têm sido identificados para existir em uma variedade de tumores malignos, incluindo câncer de pulmão, cérebro, pâncreas, próstata, mama e fígado3,4,5,6,7,8,9. A identificação de CSCs nesses tumores baseia-se principalmente na presença de proteínas de marcadores superficiais, como alta e/ou baixa expressão de CD44, CD24, CD133 e Sca-19,10, mas um marcador único que pode distinguir CSCs de não-CSCs não foi relatado até agora. Atualmente, várias técnicas são utilizadas para identificar e purificar CSCs em tecido tumoral ou linhas de células tumorais. Essas técnicas são projetadas com base nas propriedades específicas dos CSCs. Entre eles, ensaios e triagem de células da população lateral (SP) são dois dos métodos comumente utilizados.
As células-tronco de SP foram originalmente descobertas por Goodell et al.11, quando caracterizaram células-tronco hematopoiéticas em células de medula óssea do rato. Quando as células de medula óssea do rato foram rotuladas com o corante fluorescente Hoechst 33342, um pequeno grupo de células mal manchadas hoechst 33342 apareceu no gráfico de pontos bidimensionais de um ensaio de citometria de fluxo. Hoechst 33342 é um corante de ligação de DNA e tem pelo menos dois modos de ligação que levam a diferentes características espectrais. Ao visualizar a emissão de fluorescência em dois comprimentos de onda ao mesmo tempo, várias populações podem ser reveladas12. Em seu ensaio, o Hoechst 33342 estava animado a 350 nm e a fluorescência foi medida usando o filtro de banda-pass (BP) de 450/20 nm e o filtro de borda de 675 nm de passagem longa (EFLP)11. Comparado com toda a população de células de medula óssea, esse grupo de células foi enriquecido com células-tronco hematopoiéticas chamadas células-tronco de SP11. As células SP são capazes de expulsar rapidamente Hoechst 33342. O efflux deste corante está relacionado aos transportadores de de ligação ATP (ABC)13, que podem ser inibidos por alguns agentes como Fumitremorgin C14, Verapamil e Reserpine15,16. Depois disso, diferentes proporções de células de SP foram detectadas em uma variedade de tecidos, órgãos, tecidos tumorais e linhas de células tumorais17,18,19. Essas células de SP têm muitas características das células-tronco17,19.
Este manuscrito descreve a rotulagem e coloração de células tumorais cultivadas hoechst 33342 e a análise de células de SP por citometria de fluxo. Além disso, a otimização da concentração de Hoechst 33342 e a seleção adequada do bloqueador para uma linha celular tumoral específica usando esta abordagem são mostradas. Finalmente, os efeitos da promoção da haste ou sinais de inibição na proporção de SP nas células tumorais são demonstrados. Os exemplos experimentais demonstram que a análise de SP pode ser usada para explorar os efeitos de vários sinais, como expressão genética, pequenos inibidores, ativadores, citocinas e quimioterapias, sobre a haste tumoral. Comparado a outros métodos de isolamento e purificação de CSCs, como a classificação de CD44+/CD24– população, análise de aldeído desidrogenase (ALDH) e ensaios de formação da esfera tumoral, este método é mais fácil de manipular e é econômico.
Protocol
Representative Results
Discussion
Existem vários pontos-chave a serem mente para o ensaio de SP. A primeira é a seleção de um bloqueador adequado, como Verapamil ou Reserpine, para cada linha celular, pois a localização do “portão” das células sp é determinada de acordo com a posição em que um grande número de células de SP desaparece após a adição do bloqueador. Para a linha de células MDA-MB-231, a Reserpine funciona bem. No entanto, para outras linhas de celular, diferentes bloqueadores podem funcionar melhor.
<p class="jove_conte…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pela Fundação de Ciências Naturais da China 81572599, 81773124 e 81972787; Fundação de Ciência Natural da Cidade de Tianjin (China) 19JCYBJC27300; Tianjin People’s Hospital & Nankai University Collaborative Research Grant 2016rmnk005; Fundos de Pesquisa Fundamentais para as Universidades Centrais, 63191153 da Universidade de Nankai.
Materials
| 6 well cell culture plate | CORNING | 3516 | 9.5 cm2 (approx.) |
| Colivelin | MCE | HY-P1061A | Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries (BIOIND) | 04-001-1ACS | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD LSRFortessa | |
| Flow cytometer software | BD Biosciences | FACSDiva | |
| Flow cytometry analysis software | BD Biosciences | FlowJo | |
| Hoechst33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | bisBenzimide H 33342 trihydrochloride |
| Polystyrene round bottom test tube | CORNING | 352054 | 12 x 75 mm, 5mL |
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | 3,8-Diamino-5-[3-(diethylmethylammonio)propyl]-6-phenylphenanthridinium diiodide |
| Reserpine | Sigma-Aldrich | 83580 | (3β, 16β, 17α, 18β, 20α)-11,17-Dimethoxy-18-[(3,4,5-trimethoxybenzoyl)oxy]yohimban-16-carboxylic acid methyl ester |
| SKLB816 | Provided by Dr. Shengyong Yang, Sichuan University | ||
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200072 | |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | 5-[N-(3,4-Dimethoxyphenylethyl)methylamino]-2-(3,4-dimethoxyphenyl)-2-isopropylvaleronitrile hydrochloride |
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