ניתוח אוכלוסיית הצד בקווי תאים סרטניים מלאים
Summary
מוצגת שיטה נוחה, מהירה וחסכונית למדידת חלקם של תאי אוכלוסיית הצד בקווי תאים סרטניים מוצקים.
Abstract
תאי גזע סרטניים (CSCs) הם גורם חשוב לצמיחה הגידול, גרורות, הישנות. בידוד וזיהוי של CSCs הם בעלי משמעות רבה למחקר הגידול. כיום, מספר טכניקות משמשות לזיהוי וטיהור של CSCs מרקמות הגידול וקווי תאים סרטניים. הפרדה וניתוח של תאי אוכלוסיית צד (SP) הם שתיים מהשיטות הנפוצות. השיטות מסתמכות על היכולת של CSCs לגרש במהירות צבעים פלואורסצנטיים, כגון Hoechst 33342. הקולח של הצבע מזוהה עם משגרים ATP מחייב (ABC) והוא יכול להיות מעוכב על ידי מעכבי טרנספורטר ABC. שיטות להכתמת תאים סרטניים בתרבית עם Hoechst 33342 וניתוח חלקם של תאי SP שלהם על ידי cytometry זרימה מתוארים. הבדיקה הזו נוחה, מהירה וחסכונית. נתונים הנוצרים במהלך מבחנים אלה יכולים לתרום להבנה טובה יותר של השפעתם של גנים או אותות חוץ-תאיים ותאיים אחרים על תכונות הגבעול של תאים סרטניים.
Introduction
תאי גזע סרטניים (CSCs) הם תת-קבוצות של תאים עם יכולת התחדשות עצמית ופוטנציאל בידול מרובה, אשר ממלאים תפקיד חיוני בצמיחת הגידול, גרורות והישנות1,2. נכון לעכשיו, CSCs זוהו להתקיים במגוון רחב של גידולים ממאירים, כולל ריאות, מוח, לבלב, הערמונית, השד, וסרטן הכבד3,4,5,6,7,8,9. זיהוי של CSCs בגידולים אלה מבוסס בעיקר על נוכחות של חלבוני סמן פני השטח, כגון ביטוי גבוה ו / או נמוך של CD44, CD24, CD133, ו Sca-19,10, אבל סמן ייחודי שיכול להבחין בין CSCs שאינם CSCs לא דווח עד כה. כיום, מספר טכניקות משמשות כדי לזהות ולטהר CSCs ברקמת הגידול או קווי תאים סרטניים. טכניקות אלה מתוכננות בהתבסס על המאפיינים הספציפיים של CSCs. ביניהם, מבחנים ומיון של תאי אוכלוסיית צד (SP) הם שתיים מהשיטות הנפוצות.
תאי SP התגלו במקור על ידי גודל ואח’11, כאשר הם אפיינו תאי גזע hematopoietic בתאי מח עצם העכבר. כאשר תאי מח העצם של העכבר סומנו עם צבע פלואורסצנטי Hoechst 33342, קבוצה קטנה של תאים מוכתמים באפלולית Hoechst 33342 הופיעו בעלילת נקודה דו מימדית של מבחני ציטומטריה זרימה. Hoechst 33342 הוא צבע מחייב DNA ויש לו לפחות שני מצבי קשירה שמובילים למאפיינים ספקטרליים שונים. בעת צפייה פליטת פלואורסצנטיות בשני אורכי גל בו זמנית, אוכלוסיות מרובות ניתן לחשוף12. במהלך ההסתערות שלהם, Hoechst 33342 היה נרגש ב 350 ננומטר ואת הפלואורסצנטי נמדד באמצעות מסנן פס 450/20 ננומטר (BP) ו 675 ננומטר קצה מסנן ארוך לעבור (EFLP)11. בהשוואה לאוכלוסייה שלמה של תאי מח עצם, קבוצה זו של תאים הועשרה בתאי גזע hematopoietic בשם תאי SP11. תאי SP מסוגלים לגרש במהירות את Hoechst 33342. הקולח של צבע זה קשור לקלטת מחייבת ATP (ABC) טרנספורטרים13, אשר יכול להיות מעוכב על ידי סוכנים מסוימים כגון Fumitremorgin C14, Verapamil ו Reserpine15,16. לאחר מכן, פרופורציות שונות של תאי SP זוהו במגוון רקמות, איברים, רקמות גידול, וקווי תאים סרטניים17,18,19. לתאי SP אלה מאפיינים רבים של תאי גזע17,19.
כתב יד זה מתאר Hoechst 33342 תיוג וכתמים של תאים סרטניים מתורבתים וניתוח של תאי SP על ידי cytometry זרימה. יתר על כן, אופטימיזציה של ריכוז Hoechst 33342 ואת הבחירה חוסם הנכון עבור קו תא גידול ספציפי באמצעות גישה זו מוצגים. לבסוף, ההשפעות של קידום stemness או אותות עיכוב על חלקם של SP בתאי הגידול מודגמים. הדוגמאות הניסיוניות מראות שניתוח של SP יכול לשמש כדי לחקור את ההשפעות של אותות שונים, כגון ביטוי גנים, מעכבים קטנים, מפעילים, ציטוקינים וכימוקינים, על גזע הגידול. בהשוואה לשיטות אחרות לבידוד וטיהור של CSCs, כגון מיון של CD44+/CD24– אוכלוסייה, ניתוח אלדהיד דהידרוגנאז (ALDH) ומבחני היווצרות כדור הגידול, שיטה זו קלה יותר למניפולציה והיא חסכונית.
Protocol
Representative Results
Discussion
קיימות מספר נקודות מפתח שיש לזכור עבור ה- SP assay. הראשון הוא הבחירה של חוסם מתאים, כגון Verapamil או Reserpine, עבור כל קו תא, מכיוון שמיקום “השער” של תאי SP נקבע בהתאם למיקום שבו מספר גדול של תאי SP נעלמים לאחר הוספת החוסם. עבור קו התא MDA-MB-231, Reserpine עובד היטב. עם זאת, עבור קווי תאים אחרים, חוסמים שונים עשויים ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי הקרן למדעי הטבע של סין 81572599, 81773124 81972787; הקרן למדעי הטבע של העיר טיינג’ין (סין) 19JCYBJC27300; בית החולים העממי טיינג’ין & Nankai אוניברסיטת מחקר משותף מענק 2016rmnk005; קרנות מחקר בסיסיות לאוניברסיטאות המרכזיות, אוניברסיטת ננקאי 63191153.
Materials
| 6 well cell culture plate | CORNING | 3516 | 9.5 cm2 (approx.) |
| Colivelin | MCE | HY-P1061A | Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries (BIOIND) | 04-001-1ACS | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD LSRFortessa | |
| Flow cytometer software | BD Biosciences | FACSDiva | |
| Flow cytometry analysis software | BD Biosciences | FlowJo | |
| Hoechst33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | bisBenzimide H 33342 trihydrochloride |
| Polystyrene round bottom test tube | CORNING | 352054 | 12 x 75 mm, 5mL |
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | 3,8-Diamino-5-[3-(diethylmethylammonio)propyl]-6-phenylphenanthridinium diiodide |
| Reserpine | Sigma-Aldrich | 83580 | (3β, 16β, 17α, 18β, 20α)-11,17-Dimethoxy-18-[(3,4,5-trimethoxybenzoyl)oxy]yohimban-16-carboxylic acid methyl ester |
| SKLB816 | Provided by Dr. Shengyong Yang, Sichuan University | ||
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200072 | |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | 5-[N-(3,4-Dimethoxyphenylethyl)methylamino]-2-(3,4-dimethoxyphenyl)-2-isopropylvaleronitrile hydrochloride |
References
- Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).
- Batlle, E., Clevers, H. Cancer stem cells revisited. Nature Medicine. 23 (10), 1124-1134 (2017).
- Eramo, A., et al. Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population. Cell Death & Differentiation. 15 (3), 504-514 (2008).
- Kahlert, U. D., et al. CD133/CD15 defines distinct cell subpopulations with differential in vitro clonogenic activity and stem cell-related gene expression profile in in vitro propagated glioblastoma multiforme-derived cell line with a PNET-like component. Folia Neuropathologica. 50 (4), 357-368 (2012).
- Bailey, J. M., et al. DCLK1 marks a morphologically distinct subpopulation of cells with stem cell properties in preinvasive pancreatic cancer. Gastroenterology. 146 (1), 245-256 (2014).
- Hurt, E. M., Kawasaki, B. T., Klarmann, G. J., Thomas, S. B., Farrar, W. L. CD44+ CD24(-) prostate cells are early cancer progenitor/stem cells that provide a model for patients with poor prognosis. British Journal of Cancer. 98 (4), 756-765 (2008).
- Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
- Yang, Z. F., et al. Significance of CD90+ cancer stem cells in human liver cancer. Cancer Cell. 13 (2), 153-166 (2008).
- Schulenburg, A., et al. Cancer stem cells in basic science and in translational oncology: can we translate into clinical application. Journal of Hematology & Oncolcology. 8, 16 (2015).
- Park, J. W., Park, J. M., Park, D. M., Kim, D. Y., Kim, H. K. Stem Cells Antigen-1 Enriches for a Cancer Stem Cell-Like Subpopulation in Mouse Gastric Cancer. Stem Cells. 34 (5), 1177-1187 (2016).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. Journal of Experimental Medicine. 183 (4), 1797-1806 (1996).
- Goodell, M. A. Stem cell identification and sorting using the Hoechst 33342 side population (SP). Current Protocols in Cytometry. , 18 (2005).
- Begicevic, R. R., Falasca, M. ABC Transporters in Cancer Stem Cells: Beyond Chemoresistance. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2362 (2017).
- Rabindran, S. K., Ross, D. D., Doyle, L. A., Yang, W., Greenberger, L. M. Fumitremorgin C reverses multidrug resistance in cells transfected with the breast cancer resistance protein. Cancer Research. 60 (1), 47-50 (2000).
- Takara, K., et al. Differential effects of calcium antagonists on ABCG2/BCRP-mediated drug resistance and transport in SN-38-resistant HeLa cells. Molecular Medicine Reports. 5 (3), 603-609 (2012).
- Matsson, P., Pedersen, J. M., Norinder, U., Bergstrom, C. A., Artursson, P. Identification of novel specific and general inhibitors of the three major human ATP-binding cassette transporters P-gp, BCRP and MRP2 among registered drugs. Pharmaceutical Research. 26 (8), 1816-1831 (2009).
- Challen, G. A., Little, M. H. A side order of stem cells: the SP phenotype. Stem Cells. 24 (1), 3-12 (2006).
- Wu, C., Alman, B. A. Side population cells in human cancers. Cancer Letters. 268 (1), 1-9 (2008).
- Patrawala, L., et al. Side population is enriched in tumorigenic, stem-like cancer cells, whereas ABCG2+ and ABCG2- cancer cells are similarly tumorigenic. Cancer Research. 65 (14), 6207-6219 (2005).
- Yamada, M., et al. Nasal Colivelin treatment ameliorates memory impairment related to Alzheimer’s disease. Neuropsychopharmacology. 33 (8), 2020-2032 (2008).
- Marotta, L. L., et al. The JAK2/STAT3 signaling pathway is required for growth of CD44(+)CD24(-) stem cell-like breast cancer cells in human tumors. Journal of Clinical Investigation. 121 (7), 2723-2735 (2011).
- Zhang, C. H., et al. From Lead to Drug Candidate: Optimization of 3-(Phenylethynyl)-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine Derivatives as Agents for the Treatment of Triple Negative Breast Cancer. Journal of Medicnal Chemistry. 59 (21), 9788-9805 (2016).
- Tam, W. L., et al. Protein kinase C alpha is a central signaling node and therapeutic target for breast cancer stem cells. Cancer Cell. 24 (3), 347-364 (2013).
- Ibrahim, S. F., Diercks, A. H., Petersen, T. W., van den Engh, G. Kinetic analyses as a critical parameter in defining the side population (SP) phenotype. Experimental Cell Research. 313 (9), 1921-1926 (2007).
- Petriz, J. Flow cytometry of the side population (SP). Current Protocol in Cytometry. , 23 (2013).
- Hiraga, T., Ito, S., Nakamura, H. Side population in MDA-MB-231 human breast cancer cells exhibits cancer stem cell-like properties without higher bone-metastatic potential. Oncology Reports. 25 (1), 289-296 (2011).
- Shen, W., et al. ICAM3 mediates inflammatory signaling to promote cancer cell stemness. Cancer Letters. 422, 29-43 (2018).
- Koh, S. Y., Moon, J. Y., Unno, T., Cho, S. K. Baicalein Suppresses Stem Cell-Like Characteristics in Radio- and Chemoresistant MDA-MB-231 Human Breast Cancer Cells through Up-Regulation of IFIT2. Nutrients. 11 (3), 624 (2019).
- Lee, H., Park, S., Kim, J. B., Kim, J., Kim, H. Entrapped doxorubicin nanoparticles for the treatment of metastatic anoikis-resistant cancer cells. Cancer Letters. 332 (1), 110-119 (2013).
- Ota, M., et al. ADAM23 is downregulated in side population and suppresses lung metastasis of lung carcinoma cells. Cancer Science. 107 (4), 433-443 (2016).
- Wei, H., et al. The mechanisms for lung cancer risk of PM2.5 : Induction of epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell properties in human non-small cell lung cancer cells. Environmental Toxicology. 32 (11), 2341-2351 (2017).
- Prasanphanich, A. F., White, D. E., Gran, M. A., Kemp, M. L. Kinetic Modeling of ABCG2 Transporter Heterogeneity: A Quantitative, Single-Cell Analysis of the Side Population Assay. PLoS Computational Biology. 12 (11), 1005188 (2016).
- Han, H., et al. An endogenous inhibitor of angiogenesis inversely correlates with side population phenotype and function in human lung cancer cells. Oncogene. 33 (9), 1198-1206 (2014).
- Loebinger, M. R., Sage, E. K., Davies, D., Janes, S. M. TRAIL-expressing mesenchymal stem cells kill the putative cancer stem cell population. British Journal of Cancer. 103 (11), 1692-1697 (2010).
- Chiba, T., et al. Side population purified from hepatocellular carcinoma cells harbors cancer stem cell-like properties. Hepatology. 44 (1), 240-251 (2006).
- Hirschmann-Jax, C., et al. A distinct “side population” of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 101 (39), 14228-14233 (2004).
- Chen, A. Y., Yu, C., Gatto, B., Liu, L. F. DNA minor groove-binding ligands: a different class of mammalian DNA topoisomerase I inhibitors. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 90 (17), 8131-8135 (1993).
