सॉलिड ट्यूमर सेल लाइनों में साइड पॉपुलेशन का विश्लेषण
Summary
ठोस ट्यूमर सेल लाइनों में साइड पॉपुलेशन कोशिकाओं के अनुपात को मापने के लिए एक सुविधाजनक, तेज और लागत प्रभावी विधि प्रस्तुत की जाती है।
Abstract
कैंसर स्टेम सेल (सीएससी) ट्यूमर ग्रोथ, मेटास्टेसिस और ऑड-ईवन का एक अहम कारण है। ट्यूमर अनुसंधान के लिए सीएससी का अलगाव और पहचान बहुत मायने रखती है। वर्तमान में, ट्यूमर ऊतकों और ट्यूमर सेल लाइनों से सीएससी की पहचान और शुद्धिकरण के लिए कई तकनीकों का उपयोग किया जाता है। पक्ष जनसंख्या (एसपी) कोशिकाओं का पृथक्करण और विश्लेषण आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले दो तरीके हैं। विधियां सीएससी की फ्लोरोसेंट रंगों को तेजी से निष्कासित करने की क्षमता पर भरोसा करती हैं, जैसे कि होचस्ट 33342। डाई का efflux एटीपी-बाध्यकारी कैसेट (एबीसी) ट्रांसपोर्टरों के साथ जुड़ा हुआ है और एबीसी ट्रांसपोर्टर अवरोधकों द्वारा बाधित किया जा सकता है। Hoechst 33342 के साथ सुसंस्कृत ट्यूमर कोशिकाओं को धुंधला करने और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा उनके एसपी कोशिकाओं के अनुपात का विश्लेषण करने के तरीकों का वर्णन किया गया है। यह परख सुविधाजनक, तेज और लागत प्रभावी है। इस परख में उत्पन्न डेटा ट्यूमर कोशिकाओं के स्टेमनेस गुणों पर जीन या अन्य बाह्राश और इंट्रासेलुलर संकेतों के प्रभाव की बेहतर समझ में योगदान दे सकता है।
Introduction
कैंसर स्टेम सेल (सीएससी) आत्म-नवीकरण क्षमता और कई भेदभाव क्षमता वाली कोशिकाओं के सबसेट हैं, जो ट्यूमर विकास, मेटास्टेसिस और पुनरावृत्ति1,2में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। वर्तमान में, सीएससी को फेफड़े, मस्तिष्क, अग्न्याशय, प्रोस्टेट, स्तन और यकृतकैंसर3, 4,5,6,7,8,9सहित विभिन्न घातक ट्यूमर में मौजूद होने के लिएपहचानागया है। इन ट्यूमर में सीएससी की पहचान मुख्य रूप से सतह मार्कर प्रोटीन की उपस्थिति पर आधारित है, जैसे सीडी 44, सीडी24, सीडी 133, और एससीए-19,10की उच्च और/या कम अभिव्यक्ति, लेकिन एक अनूठा मार्कर जो सीएससी को गैर-सीएससी से अलग कर सकताहै,अब तक सूचित नहीं किया गया है । वर्तमान में, ट्यूमर ऊतक या ट्यूमर सेल लाइनों में सीएससी की पहचान और शुद्ध करने के लिए कई तकनीकों का उपयोग किया जाता है। इन तकनीकों को सीएससी के विशिष्ट गुणों के आधार पर डिजाइन किया गया है। उनमें से, परख और पक्ष जनसंख्या (सपा) कोशिकाओं की छंटाई आमतौर पर इस्तेमाल किया तरीकों में से दो हैं ।
एसपी कोशिकाओं को मूल रूप से गूडेल एट अल11द्वारा खोजा गया था, जब वे माउस बोन मैरो कोशिकाओं में हेमेटोपोइटिक स्टेम कोशिकाओं की विशेषता थे। जब माउस बोन मैरो कोशिकाओं को फ्लोरोसेंट डाई होचस्ट 33342 के साथ लेबल किया गया था, तो होचस्ट 33342 मंद-दाग कोशिकाओं का एक छोटा समूह प्रवाह साइटोमेट्री परख के दो आयामी डॉट प्लॉट में दिखाई दिया। Hoechst 33342 एक डीएनए-बाध्यकारी डाई है और इसमें कम से कम दो बाध्यकारी मोड हैं जो विभिन्न स्पेक्ट्रल विशेषताओं का कारण बनते हैं। जब एक ही समय में दो तरंग दैर्ध्य पर फ्लोरेसेंस उत्सर्जन को देखते हैं, तो कईआबादी 12से प्रकट हो सकती है। उनकी परख में, Hoechst ३३३४२ ३५० एनएम पर उत्साहित था और फ्लोरेसेंस 450/20 एनएम बैंड-पास (बीपी) फिल्टर और ६७५ एनएम एज फिल्टर लांग-पास (EFLP)11का उपयोग करके मापा गया था । बोन मैरो कोशिकाओं की पूरी आबादी के साथ तुलना में, कोशिकाओं के इस समूह को हेमेटोपोइटिक स्टेम कोशिकाओं से समृद्ध किया गया था जिसे एसपी सेल11कहा जाता है। एसपी सेल तेजी से Hoechst 33342 निष्कासित करने में सक्षम हैं। इस डाई का प्रभाव एटीपी-बाइंडिंग कैसेट (एबीसी) ट्रांसपोर्टर्स13से संबंधित है, जिसे कुछ एजेंटों जैसे फ्यूमिर्मेमोर्गिन सी14,वेरामिल और रेसरपाइन15, 16से बाधित किया जा सकता है। उसके बाद, विभिन्न ऊतकों, अंगों, ट्यूमर ऊतकों और ट्यूमर सेल लाइनों17, 18,19में एसपी कोशिकाओं के विभिन्नअनुपातोंका पता चला। इन एसपी सेल में स्टेम सेल17,19की कई विशेषताएं हैं .
यह पांडुलिपि होचस्ट 33342 लेबलिंग और सुसंस्कृत ट्यूमर कोशिकाओं के धुंधला और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा एसपी कोशिकाओं के विश्लेषण का वर्णन करती है। इसके अलावा, Hoechst 33342 एकाग्रता का अनुकूलन और इस दृष्टिकोण का उपयोग कर एक विशिष्ट ट्यूमर सेल लाइन के लिए उचित अवरोधक चयन दिखाया गया है। अंत में, ट्यूमर कोशिकाओं में एसपी के अनुपात पर स्टेमनेस प्रचार या अवरोध संकेतों के प्रभाव का प्रदर्शन किया जाता है। प्रायोगिक उदाहरण प्रदर्शित करते हैं कि एसपी के विश्लेषण का उपयोग ट्यूमर स्टेमनेस पर जीन अभिव्यक्ति, छोटे अवरोधक, एक्टिवेटर, साइटोकिन्स और केमोकिन जैसे विभिन्न संकेतों के प्रभावों का पता लगाने के लिए किया जा सकता है। सीएससी के अलगाव और शुद्धिकरण के लिए अन्य तरीकों की तुलना में, जैसे CD44+/CD24 की छंटाई– जनसंख्या, एल्डिहाइड डिहाइड्रोजनेज (एएलडीएच) विश्लेषण, और ट्यूमर क्षेत्र गठन परख, यह विधि हेरफेर के लिए आसान है और लागत प्रभावी है।
Protocol
Representative Results
Discussion
सपा की परख के लिए कई अहम बातें ध्यान में रखनी हैं। पहला प्रत्येक सेल लाइन के लिए वेरामिल या रेसरपाइन जैसे उचित अवरोधक का चयन है, क्योंकि सपा कोशिकाओं का “गेट” स्थान उस स्थिति के अनुसार निर्धारित किया जात?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को चीन 81572599, 81773124 और 81972787 के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन द्वारा वित्त पोषित किया गया था; तियानजिन सिटी (चीन) के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन 19JCYBJC27300; तियानजिन पीपुल्स हॉस्पिटल और नानकाई विश्वविद्यालय सहयोगी अनुसंधान अनुदान 2016rmnk005; केंद्रीय विश्वविद्यालयों के लिए मौलिक अनुसंधान कोष, नानकाई विश्वविद्यालय 63191153 ।
Materials
| 6 well cell culture plate | CORNING | 3516 | 9.5 cm2 (approx.) |
| Colivelin | MCE | HY-P1061A | Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries (BIOIND) | 04-001-1ACS | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD LSRFortessa | |
| Flow cytometer software | BD Biosciences | FACSDiva | |
| Flow cytometry analysis software | BD Biosciences | FlowJo | |
| Hoechst33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | bisBenzimide H 33342 trihydrochloride |
| Polystyrene round bottom test tube | CORNING | 352054 | 12 x 75 mm, 5mL |
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | 3,8-Diamino-5-[3-(diethylmethylammonio)propyl]-6-phenylphenanthridinium diiodide |
| Reserpine | Sigma-Aldrich | 83580 | (3β, 16β, 17α, 18β, 20α)-11,17-Dimethoxy-18-[(3,4,5-trimethoxybenzoyl)oxy]yohimban-16-carboxylic acid methyl ester |
| SKLB816 | Provided by Dr. Shengyong Yang, Sichuan University | ||
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200072 | |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | 5-[N-(3,4-Dimethoxyphenylethyl)methylamino]-2-(3,4-dimethoxyphenyl)-2-isopropylvaleronitrile hydrochloride |
References
- Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).
- Batlle, E., Clevers, H. Cancer stem cells revisited. Nature Medicine. 23 (10), 1124-1134 (2017).
- Eramo, A., et al. Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population. Cell Death & Differentiation. 15 (3), 504-514 (2008).
- Kahlert, U. D., et al. CD133/CD15 defines distinct cell subpopulations with differential in vitro clonogenic activity and stem cell-related gene expression profile in in vitro propagated glioblastoma multiforme-derived cell line with a PNET-like component. Folia Neuropathologica. 50 (4), 357-368 (2012).
- Bailey, J. M., et al. DCLK1 marks a morphologically distinct subpopulation of cells with stem cell properties in preinvasive pancreatic cancer. Gastroenterology. 146 (1), 245-256 (2014).
- Hurt, E. M., Kawasaki, B. T., Klarmann, G. J., Thomas, S. B., Farrar, W. L. CD44+ CD24(-) prostate cells are early cancer progenitor/stem cells that provide a model for patients with poor prognosis. British Journal of Cancer. 98 (4), 756-765 (2008).
- Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
- Yang, Z. F., et al. Significance of CD90+ cancer stem cells in human liver cancer. Cancer Cell. 13 (2), 153-166 (2008).
- Schulenburg, A., et al. Cancer stem cells in basic science and in translational oncology: can we translate into clinical application. Journal of Hematology & Oncolcology. 8, 16 (2015).
- Park, J. W., Park, J. M., Park, D. M., Kim, D. Y., Kim, H. K. Stem Cells Antigen-1 Enriches for a Cancer Stem Cell-Like Subpopulation in Mouse Gastric Cancer. Stem Cells. 34 (5), 1177-1187 (2016).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. Journal of Experimental Medicine. 183 (4), 1797-1806 (1996).
- Goodell, M. A. Stem cell identification and sorting using the Hoechst 33342 side population (SP). Current Protocols in Cytometry. , 18 (2005).
- Begicevic, R. R., Falasca, M. ABC Transporters in Cancer Stem Cells: Beyond Chemoresistance. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2362 (2017).
- Rabindran, S. K., Ross, D. D., Doyle, L. A., Yang, W., Greenberger, L. M. Fumitremorgin C reverses multidrug resistance in cells transfected with the breast cancer resistance protein. Cancer Research. 60 (1), 47-50 (2000).
- Takara, K., et al. Differential effects of calcium antagonists on ABCG2/BCRP-mediated drug resistance and transport in SN-38-resistant HeLa cells. Molecular Medicine Reports. 5 (3), 603-609 (2012).
- Matsson, P., Pedersen, J. M., Norinder, U., Bergstrom, C. A., Artursson, P. Identification of novel specific and general inhibitors of the three major human ATP-binding cassette transporters P-gp, BCRP and MRP2 among registered drugs. Pharmaceutical Research. 26 (8), 1816-1831 (2009).
- Challen, G. A., Little, M. H. A side order of stem cells: the SP phenotype. Stem Cells. 24 (1), 3-12 (2006).
- Wu, C., Alman, B. A. Side population cells in human cancers. Cancer Letters. 268 (1), 1-9 (2008).
- Patrawala, L., et al. Side population is enriched in tumorigenic, stem-like cancer cells, whereas ABCG2+ and ABCG2- cancer cells are similarly tumorigenic. Cancer Research. 65 (14), 6207-6219 (2005).
- Yamada, M., et al. Nasal Colivelin treatment ameliorates memory impairment related to Alzheimer’s disease. Neuropsychopharmacology. 33 (8), 2020-2032 (2008).
- Marotta, L. L., et al. The JAK2/STAT3 signaling pathway is required for growth of CD44(+)CD24(-) stem cell-like breast cancer cells in human tumors. Journal of Clinical Investigation. 121 (7), 2723-2735 (2011).
- Zhang, C. H., et al. From Lead to Drug Candidate: Optimization of 3-(Phenylethynyl)-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine Derivatives as Agents for the Treatment of Triple Negative Breast Cancer. Journal of Medicnal Chemistry. 59 (21), 9788-9805 (2016).
- Tam, W. L., et al. Protein kinase C alpha is a central signaling node and therapeutic target for breast cancer stem cells. Cancer Cell. 24 (3), 347-364 (2013).
- Ibrahim, S. F., Diercks, A. H., Petersen, T. W., van den Engh, G. Kinetic analyses as a critical parameter in defining the side population (SP) phenotype. Experimental Cell Research. 313 (9), 1921-1926 (2007).
- Petriz, J. Flow cytometry of the side population (SP). Current Protocol in Cytometry. , 23 (2013).
- Hiraga, T., Ito, S., Nakamura, H. Side population in MDA-MB-231 human breast cancer cells exhibits cancer stem cell-like properties without higher bone-metastatic potential. Oncology Reports. 25 (1), 289-296 (2011).
- Shen, W., et al. ICAM3 mediates inflammatory signaling to promote cancer cell stemness. Cancer Letters. 422, 29-43 (2018).
- Koh, S. Y., Moon, J. Y., Unno, T., Cho, S. K. Baicalein Suppresses Stem Cell-Like Characteristics in Radio- and Chemoresistant MDA-MB-231 Human Breast Cancer Cells through Up-Regulation of IFIT2. Nutrients. 11 (3), 624 (2019).
- Lee, H., Park, S., Kim, J. B., Kim, J., Kim, H. Entrapped doxorubicin nanoparticles for the treatment of metastatic anoikis-resistant cancer cells. Cancer Letters. 332 (1), 110-119 (2013).
- Ota, M., et al. ADAM23 is downregulated in side population and suppresses lung metastasis of lung carcinoma cells. Cancer Science. 107 (4), 433-443 (2016).
- Wei, H., et al. The mechanisms for lung cancer risk of PM2.5 : Induction of epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell properties in human non-small cell lung cancer cells. Environmental Toxicology. 32 (11), 2341-2351 (2017).
- Prasanphanich, A. F., White, D. E., Gran, M. A., Kemp, M. L. Kinetic Modeling of ABCG2 Transporter Heterogeneity: A Quantitative, Single-Cell Analysis of the Side Population Assay. PLoS Computational Biology. 12 (11), 1005188 (2016).
- Han, H., et al. An endogenous inhibitor of angiogenesis inversely correlates with side population phenotype and function in human lung cancer cells. Oncogene. 33 (9), 1198-1206 (2014).
- Loebinger, M. R., Sage, E. K., Davies, D., Janes, S. M. TRAIL-expressing mesenchymal stem cells kill the putative cancer stem cell population. British Journal of Cancer. 103 (11), 1692-1697 (2010).
- Chiba, T., et al. Side population purified from hepatocellular carcinoma cells harbors cancer stem cell-like properties. Hepatology. 44 (1), 240-251 (2006).
- Hirschmann-Jax, C., et al. A distinct “side population” of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 101 (39), 14228-14233 (2004).
- Chen, A. Y., Yu, C., Gatto, B., Liu, L. F. DNA minor groove-binding ligands: a different class of mammalian DNA topoisomerase I inhibitors. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 90 (17), 8131-8135 (1993).
