यहां, हम कार्यात्मक मेचनोट्रांसडुक्शन चैनलों के साथ श्रवण हेयर कोशिकाओं में 3 केडीए टेक्सास रेड-लेबल ्ड्टिन के तेज की कल्पना करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं। इसके अलावा 3-10 केडीए के डेक्सट्रांस का इस्तेमाल बालों में एंडोसाइटोसिस का अध्ययन करने और कोर्टी के अंग की कोशिकाओं का समर्थन करने के लिए किया जा सकता है।
हेयर सेल मेचनोट्रांसडुक्शन (मेट) चैनल सुनने में अहम भूमिका निभाता है। हालांकि, आणविक पहचान और MET की संरचनात्मक जानकारी अज्ञात रहते हैं । बालों की कोशिकाओं के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल अध्ययनों से पता चला है कि मेट चैनल में एक बड़ा आचरण है और अपेक्षाकृत बड़े फ्लोरोसेंट कॉइनिक अणुओं के लिए permeable है, जिसमें कुछ स्टाइलिल रंग और टेक्सास रेड-लेबल अमीनोग्लिकोसाइड एंटीबायोटिक्स शामिल हैं । इस प्रोटोकॉल में, हम कॉर्टी एक्सप्लांट्स के अंग की बालों की कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट डेक्सट्रांस की कल्पना और मूल्यांकन करने की एक विधि का वर्णन करते हैं जिसका उपयोग कार्यात्मक मेट चैनलों के लिए परख करने के लिए किया जा सकता है। हमने पाया कि 3 केडीए टेक्सास रेड-लेबल ्ड्टिन विशेष रूप से 1-2 घंटे ऊष्मायन के बाद कार्यात्मक श्रवण बाल कोशिकाओं को लेबल करता है। विशेष रूप से, 3 केडीए dextran दो छोटे स्टीरियोसिलिया पंक्तियों लेबल और एक फैलाना पैटर्न में सेल शरीर में जमा जब कार्यात्मक MET चैनल मौजूद हैं । बाल कोशिकाओं और आसपास के सहायक कोशिकाओं के सेल शरीर में लेबलिंग का एक अतिरिक्त वेसिकल जैसा पैटर्न देखा गया था। हमारे डेटा का सुझाव है कि 3 केडीए टेक्सास-लाल dextran का उपयोग सेलुलर डाये तेज के लिए दो रास्तों की कल्पना और अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है; कार्यात्मक मेट चैनलों और एंडोसाइटोसिस के माध्यम से एक हेयर सेल-विशिष्ट प्रवेश मार्ग, एक पैटर्न भी बड़े dextran के लिए उपलब्ध है।
भीतरी कान की बाल कोशिकाएं संवेदी कोशिकाएं हैं जो ध्वनि का पता लगाती हैं और विद्युत संकेतों में यांत्रिक रूप से उत्तेजनाओं को गुप्त करती हैं, जो अंततः हमारे मस्तिष्क द्वारा व्याख्या की जाती हैं। इन कोशिकाओं में एक ्सिन-आधारित फिलामेंट्स की तीन पंक्तियों का सीढ़ी के आकार का बंडल होता है, जिसे स्टीरियोसिलिया के नाम से जाना जाता है, जो उनके एपिकल क्षेत्र1,2से फैलता है। यांत्रिक उत्तेजनाओं सबसे लंबी पंक्ति की ओर स्टीरियोसिलिया फिलामेंट्स को मोड़ने और मेचनोट्रांसडुक्शन (MET)चैनलों 3के उद्घाटन को ट्रिगर करता है। मौसम चैनलों के उद्घाटन के लिए कोटेशन की आमद होती है जो कोशिका को ध्रुवीकृत करती है और इसके परिणामस्वरूप बाल कोशिका के बेसल क्षेत्र में सिनेप्स वेसिकल्स की रिहाई का संकेत देता है।
सुनवाई के लिए आवश्यक मेट चैनल के जैव भौतिक गुणों को बड़े पैमाने पर चित्रित किया गया है। अन्य गुणों में, ये चैनल कास्टिक चयनात्मक हैं और इसमें अपेक्षाकृत बड़ा आचरण (कम सीए2 +में 150-300 पीएस)4,5,6,7,8,9,10है। उल्लेखनीय है, एफएम 1-43 और टेक्सास रेड-लेबल वाले अमीनोग्लिकोसाइड्स जैसे बड़े फ्लोरोसेंट अणु मेट चैनल के परमतलब ब्लॉकर्स हैं, जिसके परिणामस्वरूप बाल कोशिका शरीर में उनका संचय होता है जिसे फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी11,12,13,14का उपयोग करके कल्पना की जा सकती है। इसके विपरीत, आणविक पहचान और मौसम चैनल की संरचना और उसके पारगम्य मार्ग मायावी बने हुए हैं । प्रायोगिक साक्ष्य बढ़ने से पता चलता है कि ट्रांसमेम्ब्रेन जैसे चैनल प्रोटीन 1 (टीएमसी1) परिपक्व बाल कोशिकाओं15,16,17,18, 19में मेट चैनल का एक घटक है। ट्रांसमेम्ब्रेन जैसे चैनल 1 (टीएमसी1) में म्यूटेशन मेट चैनल गुणों को बदल देते हैं19,20,21,22 और बहरापन का कारण बनते हैं। इसके अलावा, टीएमसी1 मेट चैनल18,23 की साइट पर स्थानीयकरण करता है और मेट चैनल24,25को यांत्रिक बल को प्रसारित करने के लिए जिम्मेदार टिप-लिंक के साथ बातचीत करता है। इसके अलावा, हाल ही में बायोइन्फॉर्मेटिक्स विश्लेषण ने टीएमसी प्रोटीन को मेचानोसेंसिटिव चैनलों TMEM63/OSCA प्रोटीन और TMEM16 प्रोटीन से संबंधित विकासवादी के रूप में पहचाना है, कैल्शियम सक्रिय क्लोराइड चैनलों और लिपिड हाथापाई26,27,28के एक परिवार । इन प्रोटीनों के बीच संबंधों के आधार पर टीएमसी1 के एक संरचनात्मक मॉडल ने प्रोटीन-लिपिड इंटरफेस27पर एक बड़ी गुहा की उपस्थिति का खुलासा किया। यह गुहा दो टीएमसी1 म्यूटेशन को आश्रय देता है जो ऑटोसोमल प्रमुख सुनवाई हानि (डीएफएनए36)27,29,30,31,32और गुहा में अवशेषों के लिए साइस्टीन म्यूटेंट के चयनात्मक संशोधन का कारण बनता है, जो मेट चैनल गुणोंको 28में बदल देता है, यह दर्शाता है कि यह मेट चैनल के पार्मेशन मार्ग के रूप में कार्य कर सकता है। टीएमसी प्रोटीन में इस भविष्यवाणी गुहा के बड़े आकार के बड़े अणुओं की क्षमता की व्याख्या करने के लिए मिले चैनल तर सकता है । इस भविष्यवाणी का परीक्षण करने के लिए कि मेट चैनल में असामान्य रूप से बड़े पार्मेशन मार्ग शामिल हैं और टीएमसी1 में देखी गई गुहा के आकार की सीमाओं को धक्का देने के लिए, हमने एक बड़े अणु के साथ कॉर्टी एक्सप्लांट्स के अंग में तेज प्रयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया, टेक्सास रेड के साथ 3 केडीए dextran फ्लोरोसेंटी लेबल।
Dextran अल्फा-1,6 ग्लाइकोसिडिक लिंकेज से बंधे कई डी-ग्लूकोज अणुओं से बना एक जटिल शाखाओं वाला पॉलीसैकराइड है। पानी में इसकी उच्च घुलनशीलता, कम सेल विषाक्तता, और बायोइनर्टिटी इसे कई सेलुलर प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक बहुमुखी उपकरण बनाती है। इसके अलावा, dextran आकार की एक विस्तृत श्रृंखला में उपलब्ध है और फ्लोरोसेंटी से कई रंगों के फ्लोरोफोरस के साथ लेबल किया जाता है। फ्लोरेसेंटी लेबल वाले डेक्सट्रांस का उपयोग आमतौर पर कोशिका और ऊतक पारगम्यता अनुसंधान33,34में किया जाता है , जो मल्टीपल सेलुलर सिस्टम35,36में एंडोसाइटोसिस का अध्ययन करने के लिए और तंत्रिका अनुरेखण37,38के लिए होता है । श्रवण क्षेत्र में, कोर्टी39,40के चिंचिला अंग में तीव्र शोर के संपर्क में आने के बाद सेल-सेल जंक्शन के व्यवधान और श्रवण संवेदी एपिथेलियम अखंडता के नुकसान का आकलन करने के लिए ड्डिशन अणुओं का भी उपयोग किया गया है।
इस काम में, हमने कुछ सबसे छोटे (3 और 10 केडीए) फ्लोरोसेंट डेक्सट्रांस के गुणों का शोषण किया ताकि रिनरी इनर इयर हेयर सेल में तेज प्रयोग किए जा सके और आंतरिक कान बाल कोशिका मेट चैनल के पारमीशन मार्ग के आकार का पता लगाया जा सके। इसके अलावा, हमने स्टीरियोसिलिया में फ्लोरोसेंट ड्वेटन और श्रवण बाल कोशिकाओं के सेल शरीर की कल्पना और स्थानीयकरण करने के लिए एयरिकस्कैन डिटेक्टर से सुसज्जित लेजर-स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप (एलएसएम) 880 का उपयोग किया।
इस प्रोटोकॉल में 3 केडीए dextran टेक्सास रेड के साथ कोर्टी एक्सप्लांट्स के मूत्र अंग में तेज प्रयोग करने का वर्णन किया गया है। इस विधि का लक्ष्य यह परीक्षण करना है कि क्या पहले परीक्षण किए गए अन्य लोगों की तु…
The authors have nothing to disclose.
हम कॉन्फोकल छवि अधिग्रहण में सहायता करने के लिए NICHD माइक्रोस्कोपी और इमेजिंग कोर से विंसेंट श्राम को धन्यवाद देते हैं, और कॉलोनी प्रबंधन और चूहों की देखभाल के साथ अमूल्य मदद के लिए टीएसजी-हुई चांग। इस शोध को NINDS, NIH, बेथेस्डा, एमडी के इंट्राम्यूरल रिसर्च प्रोग्राम द्वारा केजे एस एबी को एनआईडीडीएस, एनआईएच के इंट्राम्यूरल रिसर्च प्रोग्राम और इंट्राम्यूरल रिसर्च प्रोग्राम से रॉबर्ट वेनहोल्ड पोस्टडॉक्टोरल फेलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था । एनआईडीसीडी की।
#1.5 glass coverslips 18mm | Warner Instruments | 64-0714 | |
Alexa Fluor 488 Phalloidin | ThermoFisher | A12379 | |
Alexa Fluor 594 Phalloidin | ThermoFisher | A12381 | |
alpha Plan-Apochromat 63X/1.4 Oil Corr M27 objective | Carl Zeiss | 420780-9970-000 | |
Amiloride hydrochloride | EMD MILLIPORE | 129876 | |
Benchwaver 3-dimensional Rocker | Benchmarks scientific | B3D5000 | |
C57BL/6J wild-type mice | strain 000664 | The Jackson Laboratory | |
Cell impermeant BAPTA tetrapotassium salt | ThermoFisher | B1204 | |
Dextran, Fluorescein, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | ThermoFisher | D1820 | |
Dextran, Texas Red, 10,000 MW, Lysine Fixable | ThermoFisher | D1863 | |
Dextran, Texas Red, 3000 MW, Lysine Fixable | ThermoFisher | D3328 | |
Formaldehyde Aqueous Solution EM Grade | Electron microscopy science | 15710 | |
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14025 | |
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14170 | |
Image J or FIJI | NIH | http://fiji.sc/ | |
Immersol 518F oil immersion media | Carl Zeiss | 444970-9000-000 | |
Leibovitz's L-15 Medium, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher | 31415029 | |
neomycin trisulfate salt hydrate | Sigma | N6386 | |
PBS (10X), pH 7.4 | ThermoFisher | 70011069 | |
Phalloidin-CF405M | Biotium | 00034 | |
ProLong Diamond antifade mounting media | ThermoFisher | P36970 | |
superfrost plus microscope slide | Fisherbrand | 22-037-246 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
Zen Black 2.3 SP1 software | Carl Zeiss | https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html |