여기서, 우리는 기능성 메카노트랜스덕션 채널을 가진 청각 모발 세포에서 3 kDa 텍사스 레드 라벨 덱젠의 섭취를 시각화하는 방법을 제시한다. 또한, 3-10 kDa의 덱스 트랜스는 모발의 내분비증과 코르티 장기의 지지 세포를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
모발 세포 메카노트랜스덕션(MET) 채널은 청력에 중요한 역할을 합니다. 그러나, MET의 분자 정체성 및 구조 정보는 알려지지 않은 남아 있습니다. 모발 세포의 전기 생리학적 연구는 MET 채널이 큰 전도도를 가지며 일부 스타일 염료 및 텍사스 적색 표지 된 아미노 글리코 시드 항생제를 포함하여 상대적으로 큰 형광 양이온 분자에 투과성임을 밝혔다. 이 프로토콜에서, 우리는 기능적 MET 채널을 위한 분석하기 위하여 이용될 수 있는 Corti 이식의 기관의 머리 세포에 있는 형광 덱스트랜스의 픽업을 구상하고 평가하는 방법을 기술합니다. 우리는 3 kDa 텍사스 레드 라벨 덱스른이 1-2 시간 배양 후 기능성 청각 모발 세포를 구체적으로 라벨로 표시한다는 것을 발견했습니다. 특히, 3 kDa dextran은 기능성 MET 채널이 존재할 때 두 개의 짧은 스테레오실리아 행을 라벨하고 확산 패턴으로 세포체에 축적한다. 라벨링의 추가 소포 같은 패턴은 모발 세포와 주변 지지 세포의 세포체에서 관찰되었다. 우리의 데이터는 3 kDa 텍사스-레드 dextran가 세포 염료 관전자를 위한 2개의 통로를 구상하고 공부하기 위하여 이용될 수 있다는 것을 건의합니다; 기능성 MET 채널 및 내분비증을 통한 모발 세포 특이적 진입 경로, 더 큰 덱스렌에 사용할 수 있는 패턴.
내이의 모발 세포는 소리를 감지하고 궁극적으로 우리의 뇌에 의해 해석되는 전기 신호의 기계적 자극을 은폐하는 감각 세포입니다. 이 세포는 그들의 정점 지역1,2에서돌출하는 스테레오실리아로 알려져 있는 actin 기지를 둔 필라멘트의 3개의 행의 계단 모양 의 묶음을 가지고 있습니다. 기계적 자극은 스테레오실리아 필라멘트를 가장 긴 행쪽으로 편향시키고 메카노트랜스덕션(MET) 채널3의개구부를 트리거합니다. MET 채널의 개통은 세포를 탈분극화하고 결과적으로 모발 세포의 기저 부위에 시냅스 소포의 방출을 신호하는 양이온의 유입으로 이어집니다.
청력에 필수적인 MET 채널의 생물물리학적 특성은 광범위하게 특징지어졌습니다. 다른 특성 들 중, 이들 채널은 양이온 선택적이며 상대적으로 큰 전도도 (낮은Ca2 +에서 150-300 pS)4,5,6,7,8,9,10을갖는다. 놀랍게도, FM1-43 및 텍사스 적색 표지된 아미노글리코시드와 같은 큰 형광 분자는 MET 채널의 퍼시블 차단제이며, 형광 현미경 검사법을 사용하여 가시화될 수 있는 모발 세포체에 축적되는 결과를11,12,13,14. 반대로, 분자 정체성 및 MET 채널및 그 투과 통로의 구조는 애매하게 남아 있습니다. 증가하는 실험적 증거는 막막유사 채널 단백질 1(TMC1)이 성숙한 모발 세포15,16,17,18,19에서MET 채널의 성분임을 나타낸다. 막형 채널 1(TMC1)의 돌연변이는 MET 채널 속성19,20,21,22를 변경하고 청각 장애를 일으킨다. 또한, TMC1은 MET채널(18,23)의 부위에 국소화하고, 기계적 힘을 MET채널(24,25)으로전송하는 것을 담당하는 팁 링크와 상호작용한다. 더욱이, 최근 생물정보학 분석은 TMC 단백질을 메카노민성 채널 TMEM63/OSCA 단백질 및 TMEM16 단백질, 칼슘 활성 염화물 채널 및 지질 스크램블라제 26,27,28와관련된 진화로 확인하였으며,28. 이들 단백질 간의 관계에 기초한 TMC1의 구조적 모델은 단백질-지질계면(27)에서큰 공동의 존재를 밝혀낸다. 이 공동은 상염색체 지배적 난청(DFNA36)을 유발하는 2개의 TMC1 돌연변이(DFNA36)27,29,30,31,32,및 캐비티 내의 잔류물을 위한 시스테인 돌연변이체의 선택적 변형MET 채널특성(28)을수용하며, 이는 MET 채널의 투과 경로로서 기능할 수 있음을 나타낸다. TMC 단백질에 있는 이 예측한 구멍의 큰 규모는 MET 채널을 침투하는 큰 분자의 기능을 설명할 수 있었습니다. MET 채널이 비정상적으로 큰 투과 경로를 포함하고 TMC1에서 관찰된 공동의 크기의 한계를 밀어내기 위해, 우리는 더 큰 분자를 가진 코르티 이식의 기관에서 섭취 실험을 수행하는 프로토콜을 개발, 3 kDa dextran 형광으로 텍사스 레드로 표지.
Dextran은 알파 1,6 글리코시딕 결합에 의해 결합된 많은 D-포도당 분자로 구성된 복잡한 분지 다당류입니다. 물의 높은 용해도, 낮은 세포 독성 및 생체 불활성은 여러 세포 과정을 연구할 수있는 다목적 도구입니다. 또한, 덱스렌은 다양한 크기와 형광으로 여러 가지 색상의 형광로 표지로 제공됩니다. 형광표지덱스트랜스는 세포 및 조직 투과성 연구33,34,다중 세포 시스템35,36,및 신경 추적37,38에서내분비증을 연구하는 데 일반적으로 사용된다. 청각 분야에서, 덱스렌 분자는 또한 코르티39,40의친칠라 기관에서 강렬한 소음에 노출 된 후 세포 세포 접합의 중단 및 청각 감각 상피 무결성의 손실을 평가하는 데 사용되었습니다.
이 작품에서, 우리는 뮤린 내이 모발 세포에서 의 한 부분의 관세포 실험을 수행하고 내이 모발 세포 MET 채널의 투과 경로의 크기를 탐구하기 위해 가장 작은 (3 및 10 kDa) 형광 덱스 트랜스의 일부의 특성을 이용했다. 또한, 우리는 레이저 스캐닝 공초점 현미경 (LSM) 880을 사용하여 에어리스캔 검출기가 장착되어 입체 및 청각 모발 세포의 세포체에서 형광 덱젠을 시각화하고 국소화했습니다.
이 프로토콜은 3 kDa dextran 텍사스 레드와 코르티 이식의 뮤린 기관에서 섭취 실험을 수행하는 방법을 설명합니다. 이 방법의 목표는 이전에 시험된 그 외 보다는 더 큰 분자가 또한 특히 청각 머리 세포를 표지하고 MET 채널을 통해 침투할 수 있었다는 것을 시험하는 것입니다. 유사한 실험 프로토콜은 이전에 FM1-43 (0.56 kDa)12,19,20…
The authors have nothing to disclose.
우리는 공초점 이미지 수집을 지원하기 위한 NICHD 현미경 검사법 및 이미징 코어의 빈센트 슈람과 식민지 관리 및 마우스 관리에 귀중한 도움을 준 Tsg-Hui Chang에게 감사드립니다. 이 연구는 NINDS, NIH, 베데스다, MD의 교내 연구 프로그램에 의해 지원되었으며, K.J.S. A.B.는 NINDS, NIH의 교내 연구 프로그램과 교내 연구 프로그램에서 로버트 웬홀드 박사 후 펠로우십에 의해 지원되었습니다. NIDCD의
#1.5 glass coverslips 18mm | Warner Instruments | 64-0714 | |
Alexa Fluor 488 Phalloidin | ThermoFisher | A12379 | |
Alexa Fluor 594 Phalloidin | ThermoFisher | A12381 | |
alpha Plan-Apochromat 63X/1.4 Oil Corr M27 objective | Carl Zeiss | 420780-9970-000 | |
Amiloride hydrochloride | EMD MILLIPORE | 129876 | |
Benchwaver 3-dimensional Rocker | Benchmarks scientific | B3D5000 | |
C57BL/6J wild-type mice | strain 000664 | The Jackson Laboratory | |
Cell impermeant BAPTA tetrapotassium salt | ThermoFisher | B1204 | |
Dextran, Fluorescein, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | ThermoFisher | D1820 | |
Dextran, Texas Red, 10,000 MW, Lysine Fixable | ThermoFisher | D1863 | |
Dextran, Texas Red, 3000 MW, Lysine Fixable | ThermoFisher | D3328 | |
Formaldehyde Aqueous Solution EM Grade | Electron microscopy science | 15710 | |
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14025 | |
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14170 | |
Image J or FIJI | NIH | http://fiji.sc/ | |
Immersol 518F oil immersion media | Carl Zeiss | 444970-9000-000 | |
Leibovitz's L-15 Medium, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher | 31415029 | |
neomycin trisulfate salt hydrate | Sigma | N6386 | |
PBS (10X), pH 7.4 | ThermoFisher | 70011069 | |
Phalloidin-CF405M | Biotium | 00034 | |
ProLong Diamond antifade mounting media | ThermoFisher | P36970 | |
superfrost plus microscope slide | Fisherbrand | 22-037-246 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
Zen Black 2.3 SP1 software | Carl Zeiss | https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html |