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Bioengineering

生きた機能性マウス人工内毛細胞におけるデキストランの標識と取り込み

Published: February 08, 2020
doi:
10.3791/60769
,
1Molecular Physiology and Biophysics Section,National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health

Summary

ここでは、機能性メカノトランスダクションチャネルを有する聴覚毛髪細胞における3kDaテキサス赤ラベルデキストランの取り込みを視覚化する方法を提示する。さらに、3〜10kDaのデキトランスは、コルチの器官の毛髪および支持細胞におけるエンドサイトーシスを研究するために使用することができる。

Abstract

毛細胞メカノトランスダクション(MET)チャネルは、聴覚において重要な役割を果たしている。しかしながら、METの分子同一性と構造情報は不明のままである。毛髪細胞の電気生理学的研究により、METチャネルはコンダクタンスが大きく、スタイリル色素やテキサス赤色のアミノグリコシド系抗生物質を含む比較的大きな蛍光カチオン分子に透過性であることが明らかになった。本プロトコルでは、機能的METチャネルのアッセイに使用できるコルチ外植物の器官の毛細胞における蛍光デックストランスの取り込みを可視化し評価する方法について述べた。3 kDa テキサスレッドラベルデキストランは、1~2時間のインキュベーション後に機能性聴覚毛髪細胞に特異的にラベルを付けることがわかりました。特に、3 kDa dextranは2つの短い立体列にラベルを付け、機能的なMETチャネルが存在する場合に拡散パターンで細胞体に蓄積する。毛髪細胞および周囲の支持細胞の細胞体内で、さらなる小胞様の標識パターンが認められた。我々のデータは、3 kDaテキサスレッドデキストランを使用して、細胞染料取り込みのための2つの経路を視覚化し、研究することができることを示唆している。機能的なMETチャネルおよびエンドサイトーシスを通る毛髪細胞特異的なエントリルート、より大きなデキストランにも利用できるパターン。

Introduction

内耳の毛細胞は、音を検出し、最終的に私たちの脳によって解釈される電気信号の機械的刺激を隠す感覚細胞です。これらの細胞は、立体領域1、2から突き出た立体基のフィラメントの3列の階段状の束を有する。機械的刺激は、ステレオシリアフィラメントを最長の列に向かって偏向させ、メカノトランスダクション(MET)チャネル3の開口部を引き起こす。METチャネルの開口部は、細胞を脱分極し、その結果、毛細胞の基底領域でシナプス小胞の放出を知らせるカチベーションの流入につながります。

聴覚に不可欠なMETチャネルの生物物理学的特性は広範囲に特徴付けられている。他の特性の中でも、これらのチャネルはカチオン選択的であり、比較的大きなコンダクタンス(低Ca2+で150〜300 pS)4、5、6、7、8、9、10を有する。驚くべきことに、FM1-43およびテキサス赤標識アミノグリコシドのような大きな蛍光分子は、METチャネルの過透過遮断薬であり、蛍光顕微鏡11、12、13、14を用いて可視化することができる毛髪体内での蓄積をもたらす。逆に、METチャネルの分子同一性と構造とその透過経路は、依然として不可解なままである。実験証拠の増加は、膜貫通様チャネルタンパク質1(TMC1)が成熟した毛細胞15、16、17、18、19におけるMETチャネルの成分であることを示す。膜貫通チャネル1(TMC1)の突然変異は、METチャネル特性19、20、21、22を変化させ、難聴を引き起こす。また、TMC1はMETチャネル18,23の部位に局地化し、METチャネル24,25に機械的力を伝達するチップリンクと相互作用する。さらに、最近のバイオインフォマティクス解析では、TMCタンパク質がメカ感受性チャネルTMEM63/OSCAタンパク質およびTMEM16タンパク質、カルシウム活性塩化物チャネルおよび脂質スクランブラース26、27、28に関連する進化的なものであると同定されている。これらのタンパク質の関係に基づくTMC1の構造モデルは、タンパク質-脂質界面27における大きな空洞の存在を明らかにした。この空洞は、常染色体優性難聴(DFNA36)27、29、30、31、32を引き起こす2つのTMC1変異を収容し、また、空洞内の残基に対するシステイン突然変異体の選択的改変はMETチャネル特性28を変化させ、METチャネルの透過経路として機能し得る可能性があることを示す。TMCタンパク質におけるこの予測空洞の大きなサイズは、METチャネルに浸透する大きな分子の能力を説明することができる。METチャネルに異常に大きな浸透経路が含まれているという予測をテストし、TMC1で観察された空洞の大きさの限界を押し広げるために、テキサスレッドで蛍光標識された3kDaデキストランを大きな分子を有するコルチ外植体の器官で取り込み実験を行うプロトコルを開発した。

デキストランは、α-1,6グリコシド結合によって結合された多くのD-グルコース分子から構成される複雑な分岐多糖である。水、低細胞毒性、およびバイオインナーティの高い溶解性は、いくつかの細胞プロセスを研究するための汎用性の高いツールになります。さらに、デキストランは、サイズの広い範囲で利用可能であり、蛍光色に複数の色の蛍光体で標識されています。蛍光標識デックストランスは、細胞および組織透過性研究33、34において一般的に使用され、複数の細胞系システム35、36、および神経追跡37、38におけるエンドサイトーシスを研究する。聴覚分野では、デキストラン分子はまた、コルチ39、40のチンチラ器官の強烈な騒音にさらされた後の細胞接合の破壊および聴覚上皮完全性の喪失を評価するためにも使用されている。

本研究では、最小(3~10kDa)の蛍光デクトランスの特性を利用して、マウス内耳毛髪細胞の取り込み実験を行い、内耳毛細胞METチャネルの透過経路の大きさを調べた。また、エアリスキャン検出器を搭載したレーザー走査共焦点顕微鏡(LSM)880を用いて、立体性と聴覚毛細胞の細胞体で蛍光デキストランを可視化し、局在化しました。

Protocol

動物のケアと実験手順は、国立神経障害・脳卒中研究所(KJSに#1336動物プロトコル)の動物ケアおよび使用委員会によって承認された実験動物のケアと使用のガイドラインに従って行われました。 1. マウス ごみの生年月日を制御し、子犬の年齢を追跡するために動物施設で繁殖するC57BL / 6J野生型の繁殖ペアのカップルを設定します。 2. コク?…

Representative Results

我々は、テキサスレッド(dextran-TR)で蛍光標識された3kDaデキストランを有する野生型出生後6日目(P6)マウスからのコルチ外植物の器官の2hインキュベーション後の毛細胞の堅牢かつ特異的な標識を観察した(図2A-B)。デキストランの標識は、コルチの器官の基底、中、および尖部領域での内側および外側の毛細胞(IHCおよびOHC)の両方で観察された(…

Discussion

このプロトコルは、3 kDa デキストランテキサスレッドとコルチ外植物のマウスの器官で取り込み実験を行う方法について説明します。この方法の目的は、以前にテストされた他の分子よりも大きい分子が、METチャネルを通して聴覚毛細胞を特異的に標識し、浸透させることができたかどうかをテストすることです。同様の実験プロトコルは、FM1-43(0.56 kDa)12、19、20および<…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

NICHD顕微鏡・イメージングコアのヴィンセント・シュラム氏が共焦点画像取得を支援してくれたことに感謝し、Tsg-Hui Chang氏はコロニー管理とマウスケアに非常に役立ててくれたことに感謝します。この研究は、NINDS、NIH、ベシスダ、MD、K.J.S.A.B.の壁内研究プログラムによって支援されました NINDSの壁内研究プログラム、およびロバート・ウェントホールド博士フェローシップによって支えられたの。

Materials

#1.5 glass coverslips 18mm Warner Instruments 64-0714
Alexa Fluor 488 Phalloidin ThermoFisher A12379
Alexa Fluor 594 Phalloidin ThermoFisher A12381
alpha Plan-Apochromat 63X/1.4 Oil Corr M27 objective Carl Zeiss 420780-9970-000
Amiloride hydrochloride EMD MILLIPORE 129876
Benchwaver 3-dimensional Rocker Benchmarks scientific B3D5000
C57BL/6J wild-type mice strain 000664 The Jackson Laboratory
Cell impermeant BAPTA tetrapotassium salt ThermoFisher B1204
Dextran, Fluorescein, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable ThermoFisher D1820
Dextran, Texas Red, 10,000 MW, Lysine Fixable ThermoFisher D1863
Dextran, Texas Red, 3000 MW, Lysine Fixable ThermoFisher D3328
Formaldehyde Aqueous Solution EM Grade Electron microscopy science 15710
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red ThermoFisher 14025
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red ThermoFisher 14170
Image J or FIJI NIH http://fiji.sc/
Immersol 518F oil immersion media Carl Zeiss 444970-9000-000
Leibovitz's L-15 Medium, GlutaMAX Supplement ThermoFisher 31415029
neomycin trisulfate salt hydrate Sigma N6386
PBS (10X), pH 7.4 ThermoFisher 70011069
Phalloidin-CF405M Biotium 00034
ProLong Diamond antifade mounting media ThermoFisher P36970
superfrost plus microscope slide Fisherbrand 22-037-246
Triton X-100 Sigma T8787
Zen Black 2.3 SP1 software Carl Zeiss https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html
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Ballesteros, A., Swartz, K. J. Dextran Labeling and Uptake in Live and Functional Murine Cochlear Hair Cells. J. Vis. Exp. (156), e60769, doi:10.3791/60769 (2020).
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