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Bioengineering

Etichette e acquisizioni Dextran nelle cellule dei capelli Murine Cochlear dal vivo e funzionali

Published: February 08, 2020
doi:
10.3791/60769
,
1Molecular Physiology and Biophysics Section,National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health

Summary

Qui, presentiamo un metodo per visualizzare l’assorbimento di 3 kDa Texas Red-etichetta tono in cellule ciliate uditive con canali di meccanotrazione funzionali. Inoltre, dextrans di 3-10 kDa può essere utilizzato per studiare l’endocitosi nei capelli e le cellule di supporto dell’organo di Corti.

Abstract

Il canale mechanotransduzione delle cellule ciliate (MET) svolge un ruolo importante nell’udito. Tuttavia, l’identità molecolare e le informazioni strutturali del MET rimangono sconosciute. Studi elettrofisiologici sulle cellule ciliate hanno rivelato che il canale MET ha una grande conduttanza ed è permeabile a molecole cazionali fluorescenti relativamente grandi, tra cui alcuni coloranti di stiryl e antibiotici aminoglycoside etichettati con marchio rosso texas. In questo protocollo, descriviamo un metodo per visualizzare e valutare l’assorbimento di dextrans fluorescente nelle cellule ciliate dell’organo di espianti Corti che può essere utilizzato per testare i canali MET funzionali. Abbiamo scoperto che 3 kDa Texas Red-labeld è etichettato specificamente sulle cellule ciliate uditive funzionali dopo l’incubazione di 1-2 h. In particolare, 3 kDa dextran etichetta le due file stereocilia più corte e si accumula nel corpo cellulare in un modello diffuso quando sono presenti canali MET funzionali. Un ulteriore modello vescino-come di etichettatura è stato osservato nel corpo cellulare delle cellule ciliate e circostante le cellule di supporto. I nostri dati suggeriscono che 3 kDa Texas-Red dextran può essere utilizzato per visualizzare e studiare due percorsi per l’assorbimento del coloranti cellulare; un percorso di ingresso specifico per le cellule di capelli attraverso canali MET funzionali e l’endocitosi, un modello disponibile anche per dextran più grandi.

Introduction

Le cellule ciliate dell’orecchio interno sono le cellule sensoriali che rilevano il suono e coprono gli stimoli meccanici nei segnali elettrici, che alla fine vengono interpretati dal nostro cervello. Queste celle hanno un fascio a forma di scala di tre file di filamenti a base di actina, noto come stereocilia, che sporgono dalla loro regione apicale1,2. Gli stimoli meccanici deviano i filamenti di stereocilia verso la fila più lunga e innescano l’apertura della meccanotransduzione (MET) canali3. L’apertura dei canali MET porta ad un afflusso di cations che depolarizza la cellula e di conseguenza segnala il rilascio di vescicoli sinapsi nella regione basale della cellula ciliata.

Le proprietà biofisiche del canale MET essenziali per l’udito sono state ampiamente caratterizzate. Tra le altre proprietà, questi canali sono cationic selettivo e hanno una conduttanza relativamente grande (150-300 pS in basso Ca2 ,)4,5,6,7,8,9,10. Sorprendentemente, grandi molecole fluorescenti come FM1-43 e Texas Red-etichettato aminoglycosides sono permeant bloccanti del canale MET, con conseguente loro accumulo nel corpo delle cellule dei capelli che può essere visualizzato utilizzando la microscopia a fluorescenza11,12,13,14. Al contrario, l’identità molecolare e la struttura del canale MET e il suo percorso di permeazione sono rimasti sfuggentemente. Sempre più prove sperimentali indicano che la proteina del canale transmembrana 1 (TMC1) è un componente del canale MET nelle cellule ciliate mature15,16,17,18,19. Le mutazioni nel canale 1 (TMC1) simile alla transmembrana alterano le proprietà del canale MET19,20,21,22 e causano sordità. Inoltre, TMC1 localizza al sito del canale MET18,23 e interagisce con il tip-link responsabile della trasmissione della forza meccanica al canale MET24,25. Inoltre, una recente analisi bioinformatica ha identificato le proteine TMC come evolutive relative ai canali meccanosensibili tMEM63/OSCA e alle proteine TMEM16, una famiglia di canali di cloruro attivati dal calcio e scramblases lipidici26,27,28. Un modello strutturale di TMC1 basato sulla relazione tra queste proteine ha rivelato la presenza di una grande cavità all’interfaccia proteina-lipidico27. Questa cavità ospita le due mutazioni di TMC1 che causano la perdita dell’udito autosomica dominante (DFNA36)27,29,30,31,32, e la modifica selettiva dei mutanti di cisteina per i residui nelle proprietà del canale MET della cavità28, indicando che potrebbe funzionare come percorso di permeazione del canale MET. Le grandi dimensioni di questa cavità prevista nelle proteine TMC potrebbero spiegare la capacità di molecole di grandi dimensioni di permeare il canale MET. Per testare la previsione che il canale MET contenga un percorso di permeazione insolitamente grande e per spingere i limiti delle dimensioni della cavità osservata in TMC1, abbiamo sviluppato un protocollo per eseguire esperimenti di assorbimento nell’organo di Antipiante di Corti con una molecola più grande, 3 kDa dextran fluorescente etichettata con Texas Red.

Dextran è un complesso polisaccaride ramificato composto da molte molecole di D-glucosio legate da collegamenti alfa-1,6 glicosidici. La sua elevata solubilità nell’acqua, la bassa tossicità cellulare e la bioinertità lo rendono uno strumento versatile per studiare diversi processi cellulari. Inoltre, dextran è disponibile in una vasta gamma di dimensioni e fluorescente etichettato con fluorofori di diversi colori. Fluorescently etichettato dextrans sono comunemente utilizzati nella ricerca di permeabilità cellulare e tessuto33,34, per studiare l’endocitosi in più sistemi cellulari35,36, e per la traccia neurale37,38. Nel campo uditivo, le molecole di dextran sono state utilizzate anche per valutare la rottura della giunzione cellulare-cellula e la perdita dell’integrità dell’epitelio sensoriale uditivo dopo l’esposizione a rumore intenso nell’organo cincillà di Corti39,40.

In questo lavoro, abbiamo sfruttato le proprietà di alcuni dei più piccoli (3 e 10 kDa) dextrans fluorescenti per eseguire esperimenti di assorbimento nelle cellule ciliate dell’orecchio interno murine ed esplorare le dimensioni del percorso di permeazione del canale MET della cellula capelli interna. Inoltre, abbiamo utilizzato un microscopio confocale a scansione laser (LSM) 880 dotato di un rilevatore Airyscan per visualizzare e localizzare dextran fluorescente in stereocilia e nel corpo cellulare delle cellule ciliate uditive.

Protocol

Le procedure di cura e sperimentazione degli animali sono state eseguite seguendo le linee guida per la cura e l’uso degli animali da laboratorio, che sono state approvate dal Comitato per la cura e l’uso degli animali dell’Istituto nazionale di disturbi neurologici e ictus (protocollo animale #1336 a KJS). 1. Topi Impostare un paio di coppie riproduttive di tipo C57BL/6J per riprodursi nella struttura animale per controllare la data di nascita delle cucciolate e tenere traccia dell’…

Representative Results

Abbiamo osservato un’etichettatura robusta e specifica delle cellule ciliate dopo l’incubazione di 2h di organi di espianti Corti da topi postnatali-giorno-6 (P6) di tipo selvaggio con 3 kDa dextran fluorescente etichettati con Texas Red (dextran-TR) (Figura 2A-B). L’etichettatura Dextran è stata osservata nelle cellule ciliate interne ed esterne (IHC e OHC) nelle regioni basale, centrale e apicale dell’organo di Corti(Figura 2B).</stro…

Discussion

Questo protocollo descrive come eseguire esperimenti di assorbimento nell’organo murno degli esoti di Corti con 3 kDa dextran Texas Red. L’obiettivo di questo metodo è quello di verificare se le molecole più grandi di altre precedentemente testate sono state anche in grado di etichettare specificamente le cellule ciliate uditive e permeare attraverso il canale MET. Protocolli sperimentali simili sono stati precedentemente utilizzati per valutare la permeabilità delle cellule ciliate ad altri coloranti fluorescenti com…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo Vincent Schram del nucleo di microscopia e imaging NICHD per aver aiutato nell’acquisizione di immagini confocali, e Tsg-Hui Chang per un aiuto inestimabile con la gestione delle cozioni e la cura dei topi. Questa ricerca è stata sostenuta dal Programma di Ricerca Intramurale del NINDS, NIH, Bethesda, MD, a K.J.S. A.B. è stata supportata dal Programma di Ricerca Intramurale del NINDS, NIH, e da una Robert Wenthold Postdoctoral Fellowship del programma di ricerca intramurale del NIDCD.

Materials

#1.5 glass coverslips 18mm Warner Instruments 64-0714
Alexa Fluor 488 Phalloidin ThermoFisher A12379
Alexa Fluor 594 Phalloidin ThermoFisher A12381
alpha Plan-Apochromat 63X/1.4 Oil Corr M27 objective Carl Zeiss 420780-9970-000
Amiloride hydrochloride EMD MILLIPORE 129876
Benchwaver 3-dimensional Rocker Benchmarks scientific B3D5000
C57BL/6J wild-type mice strain 000664 The Jackson Laboratory
Cell impermeant BAPTA tetrapotassium salt ThermoFisher B1204
Dextran, Fluorescein, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable ThermoFisher D1820
Dextran, Texas Red, 10,000 MW, Lysine Fixable ThermoFisher D1863
Dextran, Texas Red, 3000 MW, Lysine Fixable ThermoFisher D3328
Formaldehyde Aqueous Solution EM Grade Electron microscopy science 15710
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red ThermoFisher 14025
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red ThermoFisher 14170
Image J or FIJI NIH http://fiji.sc/
Immersol 518F oil immersion media Carl Zeiss 444970-9000-000
Leibovitz's L-15 Medium, GlutaMAX Supplement ThermoFisher 31415029
neomycin trisulfate salt hydrate Sigma N6386
PBS (10X), pH 7.4 ThermoFisher 70011069
Phalloidin-CF405M Biotium 00034
ProLong Diamond antifade mounting media ThermoFisher P36970
superfrost plus microscope slide Fisherbrand 22-037-246
Triton X-100 Sigma T8787
Zen Black 2.3 SP1 software Carl Zeiss https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html
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Ballesteros, A., Swartz, K. J. Dextran Labeling and Uptake in Live and Functional Murine Cochlear Hair Cells. J. Vis. Exp. (156), e60769, doi:10.3791/60769 (2020).
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