Здесь мы представляем метод визуализации поглощения 3 kDa Техас Красная маркировка dextran в слуховых волосяных клеток с функциональными каналами механотрансдукции. Кроме того, декстран т 3-10 кДа может быть использован для изучения эндоцитоза волос и поддерживающих клеток органа Корти.
Канал механотрансдукции волосковых клеток (MET) играет важную роль в слухе. Тем не менее, молекулярная идентичность и структурная информация MET остаются неизвестными. Электрофизиологические исследования волосковых клеток показали, что канал MET имеет большую проводимость и проницаем к относительно большим флуоресцентным катионным молекулам, включая некоторые красители из стирила и техасские антибиотики аминогликозид. В этом протоколе мы описываем метод визуализации и оценки поглощения флуоресцентного декстранта в волосяных клетках органа корти-эксрастенив, которые могут быть использованы для оценки функциональных каналов MET. Мы обнаружили, что 3 kDa Техас Красная маркировка dextran специально этикетки функциональных слуховых волосяных клеток после 1-2 ч инкубации. В частности, 3 kDa dextran маркирует два коротких стереоционных ряда и накапливается в клеточном теле в диффузном рисунке при появке функциональных каналов MET. Дополнительная везикум-подобная картина маркировки наблюдалась в клеточном теле волосковых клеток и окружающих поддерживающих клеток. Наши данные показывают, что 3 kDa Техас-Красный dextran может быть использован для визуализации и изучения двух путей для клеточного поглощения красителя; волосяных клеток конкретных входных маршрутов через функциональные каналы MET и эндоцитоза, шаблон также доступны для больших dextran.
Волосковые клетки внутреннего уха являются сенсорными клетками, которые обнаруживают звук и скрытые механически стимулы в электрических сигналах, которые в конечном счете интерпретируются нашим мозгом. Эти клетки имеют лестницу формы пучок из трех рядов actin основе нити, известный как стереосциты, которые выступают из их apical области1,2. Механические стимулы отклонять стереоцильные нити к длинному ряду и вызвать открытие механотрансдукции (MET) каналов3. Открытие каналов MET приводит к притоку катионов, которые деполяризуют клетку и, следовательно, сигнализирует о высвобождении синепсных пузырьков в базальной области волосяной клетки.
Биофизические свойства канала MET, необходимые для слуха, были широко охарактеризованы. Среди других свойств, эти каналы катионные селективного и имеют относительно большую проводимость (150-300 рС в низких Ca2 “4,5,6,7,8,9,10. Примечательно, что большие флуоресцентные молекулы, такие как FM1-43 и Техас Красной маркировкой аминогликозиды являются permeant блокаторы канала MET, в результате чего их накопление в теле волосяных клеток, которые могут быть визуализированы с помощью флуоресценции микроскопии11,12,13,14. И наоборот, молекулярная идентичность и структура канала МЕТ и его проницаемый путь остаются неуловимыми. Все больше экспериментальных данных указывает на то, что трансмембранно-подобный канал белка 1 (TMC1) является компонентом канала MET в зрелых волосковых клетках15,16,17,18,19. Мутации в трансмемембранном канале 1 (TMC1) изменяют свойства канала MET19,20,21,22 и вызывают глухоту. Кроме того, TMC1 локализуется на сайте канала MET18,23 и взаимодействует с наконечником-ссылкой, ответственной за передачу механической силы на канал MET24,25. Кроме того, недавний анализ биоинформатики определил белки TMC как эволюционные, связанные с механочувствительными каналами TMEM63/OSCA белков и TMEM16 белков, семейство кальциевых каналов хлорида и липидных скремблазов26,27,28. Структурная модель TMC1, основанная на взаимосвязи между этими белками, выявила наличие большой полости при белково-липидном интерфейсе27. Эта полость гавани две мутации TMC1, которые вызывают аутосомно-доминантной потери слуха (DFNA36)27,29,30,31,32, и селективной модификации цистеина мутантов для остатков в полости изменить СВОЙСТВА канала МЕТ28, указывая, что он может функционировать как пермяцкий путь канала MET. Большой размер этой предсказанной полости в белках TMC может объяснить способность больших молекул проникать в канал MET. Чтобы проверить предсказание о том, что канал MET содержит необычайно большой проницательный путь и раздвинуть пределы размера полости, наблюдаемые в TMC1, мы разработали протокол для проведения экспериментов по поглощению в органе Эксплансов Корти с более крупной молекулой, 3 kDa dextran флуоресцентно помечены Техас Красный.
Dextran представляет собой сложный разветвленный полисахарид, состоящий из многих молекул D-глюкозы, связанных альфа-1,6 гликозидными связями. Его высокая растворимость в воде, низкая токсичность клеток и биоинертность делают его универсальным инструментом для изучения нескольких клеточных процессов. Кроме того, dextran доступен в широком диапазоне размеров и флуоресцентно помечены флюорофорами нескольких цветов. Флуоресцентно помечены dextrans обычно используются в клетках и ткани проницаемости исследований33,34, для изучения эндоцитоза в нескольких клеточных систем35,36, и для нервной трассировки37,38. В слуховой области, dextran молекулы также были использованы для оценки нарушения клеточного соединения и потери слуховой сенсорной целостности эпителия после воздействия интенсивного шума в органе шиншиллы Корти39,40.
В этой работе мы использовали свойства некоторых из самых маленьких (3 и 10 kDa) флуоресцентных dextrans для выполнения экспериментов поглощения в мурин внутренних волосковых клеток уха и изучить размер проницательного пути внутреннего уха волос ячеек MET канала. Кроме того, мы использовали лазерный сканирование конфокального микроскопа (LSM) 880, оснащенного детектором Airyscan для визуализации и локализации флуоресцентного декесцентного декесцентного на стереосилиях и клеточном теле слуховых волосковых клеток.
Этот протокол описывает, как выполнять эксперименты поглощения в мурин органа Корти explants с 3 kDa dextran Texas Red. Цель этого метода состоит в том, чтобы проверить, были ли молекулы больше, чем другие ранее протестированные, также способными специально маркировать слуховые волосковые клетки и п?…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Винсента Шрама (Vincent Schram) из nicHD микроскопии и ядра изображений за помощь в приобретении конфокальных изображений, а Tsg-Hui Chang за неоценимую помощь в управлении колониями и по уходу за мышами. Это исследование было поддержано Intramural исследовательской программы NINDS, NIH, Bethesda, MD, к K.J.S. A.B. была поддержана Программа интрамуральных исследований NINDS, NIH, и Роберт Wenthold Postdoctoral стипендию от программы интрамуральных исследований NIDCD.
#1.5 glass coverslips 18mm | Warner Instruments | 64-0714 | |
Alexa Fluor 488 Phalloidin | ThermoFisher | A12379 | |
Alexa Fluor 594 Phalloidin | ThermoFisher | A12381 | |
alpha Plan-Apochromat 63X/1.4 Oil Corr M27 objective | Carl Zeiss | 420780-9970-000 | |
Amiloride hydrochloride | EMD MILLIPORE | 129876 | |
Benchwaver 3-dimensional Rocker | Benchmarks scientific | B3D5000 | |
C57BL/6J wild-type mice | strain 000664 | The Jackson Laboratory | |
Cell impermeant BAPTA tetrapotassium salt | ThermoFisher | B1204 | |
Dextran, Fluorescein, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | ThermoFisher | D1820 | |
Dextran, Texas Red, 10,000 MW, Lysine Fixable | ThermoFisher | D1863 | |
Dextran, Texas Red, 3000 MW, Lysine Fixable | ThermoFisher | D3328 | |
Formaldehyde Aqueous Solution EM Grade | Electron microscopy science | 15710 | |
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14025 | |
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14170 | |
Image J or FIJI | NIH | http://fiji.sc/ | |
Immersol 518F oil immersion media | Carl Zeiss | 444970-9000-000 | |
Leibovitz's L-15 Medium, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher | 31415029 | |
neomycin trisulfate salt hydrate | Sigma | N6386 | |
PBS (10X), pH 7.4 | ThermoFisher | 70011069 | |
Phalloidin-CF405M | Biotium | 00034 | |
ProLong Diamond antifade mounting media | ThermoFisher | P36970 | |
superfrost plus microscope slide | Fisherbrand | 22-037-246 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
Zen Black 2.3 SP1 software | Carl Zeiss | https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html |