JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

Dextran Märkning och upptag i levande och funktionella murine cochlear hårceller

Published: February 08, 2020
doi:
10.3791/60769
,
1Molecular Physiology and Biophysics Section,National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health

Summary

Här presenterar vi en metod för att visualisera upptaget av 3 kDa Texas Rödmärkt dextran i auditiva hårceller med funktionella mechanotransduction kanaler. Dessutom kan dextrans av 3-10 kDa användas för att studera endocytos i hår och stödjande celler i organet i Corti.

Abstract

Hårcellmechanotransduktion (MET) kanal spelar en viktig roll i hörseln. Den molekylära identiteten och den strukturella informationen i marknadsekonomisk status är dock fortfarande okänd. Elektrofysiologiska studier av hårceller visade att MET kanalen har en stor ledning och är genomsläpplig för relativt stora fluorescerande katjoniska molekyler, inklusive vissa styrylfärgämnen och Texas Röd-märkta aminoglykosid antibiotika. I detta protokoll beskriver vi en metod för att visualisera och utvärdera upptaget av fluorescerande dextrans i hårceller i organet i Kortti-utväxter som kan användas för att analysera funktionella MET-kanaler. Vi fann att 3 kDa Texas Rödmärkta dextran specifikt etiketter funktionella auditiva hårceller efter 1-2 h inkubation. I synnerhet etiketter 3 kDa dextran de två kortare stereociliaraderna och ackumuleras i cellkroppen i ett diffust mönster när funktionella MET-kanaler finns. Ytterligare vesicle-liknande mönster av märkning observerades i cellkroppen av hårceller och omgivande stödjande celler. Våra data tyder på att 3 kDa Texas-Red dextran kan användas för att visualisera och studera två vägar för cellulära färgning upptag; en hårcellspecifik ingångsväg genom funktionella MET-kanaler och endocytos, ett mönster som också finns tillgängligt för större dextran.

Introduction

Innerörats hårceller är de sensoriska celler som detekterar ljud och döljer mekaniskt stimuli i elektriska signaler, som i slutändan tolkas av vår hjärna. Dessa celler har en trappa-formad bunt av tre rader av aktin-baserade glödtrådar, känd som stereocilia, som sticker ut från deras apical region1,2. Den mekaniska stimuli avleda stereocilia filament mot den längsta raden och utlösa öppnandet av mechanotransduction (MET) kanaler3. Öppnandet av MET kanaler leder till en tillströmning av katjoner som depolariserar cellen och följaktligen signalerar utsläpp av synaps blåsor i den basala regionen i hårcellen.

De biofysiska egenskaperna hos MET-kanalen som är nödvändig för hörseln har i stor utsträckning karakteriserats. Dessa kanaler är bland annat katjoniskt selektiva och har en relativt stor kontring (150–300 pS i låg Ca2+)4,5,6,7,8,9,10. Anmärkningsvärt, stora fluorescerande molekyler som FM1-43 och Texas Rödmärkta aminoglykosider är permeant blockerare av MET kanalen, vilket resulterar i deras ackumulering i hårcellen kroppen som kan visualiseras med fluorescensmikroskopi11,12,13,14. Omvänt har den molekylära identiteten och strukturen hos MET-kanalen och dess genommektväg förblivit svårfångad. Ökande experimentella bevis tyder på att transmembrane-liknande kanal protein 1 (TMC1) är en komponent i MET kanalen i mogna hårceller15,16,17,18,19. Mutationer i transmembrane-liknande kanal 1 (TMC1) ändra MET kanal egenskaper19,20,21,22 och orsaka dövhet. Dessutom lokaliserar TMC1 till platsen för MET-kanalen18,23 och interagerar med den spets-länk som ansvarar för att överföra den mekaniska kraften till MET-kanalen24,25. Dessutom har den senaste bioinformatikanalysen identifierat TMC-proteinerna som evolutionära relaterade till de mechanokänsliga kanalerna TMEM63/OSCA-proteiner och TMEM16-proteinerna, en familj av kalciumaktiverade kloridkanaler och lipidförvrängningar26,27,28. En strukturell modell av TMC1 baserat på förhållandet mellan dessa proteiner visade förekomsten av en stor hålighet vid protein-lipid gränssnitt27. Detta hålighet hyser de två TMC1 mutationer som orsakar autosomal atypiska dominerande hörselnedsättning (DFNA36)27,29,30,31,32, och selektiv modifiering av cystein mutanter för rester i hålrummet ändra MET kanal egenskaper28, vilket tyder på att det kan fungera som permeation väg MET kanalen. Den stora storleken på denna förutspådde hålighet i TMC proteiner kan förklara förmågan hos stora molekyler att genomsyra MET kanalen. För att testa förutsägelsen att MET-kanalen innehåller en ovanligt stor permeationsväg och för att tänja på gränserna för storleken på håligheten som observerats i TMC1, utvecklade vi ett protokoll för att utföra upptag experiment i organet i Korti explants med en större molekyl, 3 kDa dextran fluorescerande märkt med Texas Red.

Dextran är en komplex grenade polysackarider bestående av många D-glukosmolekyler bundna av alfa-1,6 glykosidiska kopplingar. Dess höga löslighet i vatten, låg celltoxicitet och bioinertitet gör det till ett mångsidigt verktyg för att studera flera cellulära processer. Dessutom finns dextran i ett brett spektrum av storlekar och fluorescerande märkta med fluorofforer av flera färger. Fluorescerande märkta dextrans används ofta i cell och vävnad permeabilitet forskning33,34, att studera endocytos i flera cellulära system35,36, och för neural spårning37,38. Inom hörselfältet har dextranmolekyler också använts för att bedöma störningarna i cellcellkorsningen och förlusten av hörselsensorisksensorisk tjusateletintegritet efter exponering för intensivt buller i chinchillaorganet i Corti39,40.

I detta arbete utnyttjade vi egenskaperna hos några av de minsta (3 och 10 kDa) fluorescerande dextrans att utföra upptag experiment i murine innerörat hårceller och utforska storleken på permeation vägen för innerörat hårcell MET kanal. Dessutom använde vi en laser-scanning confocal mikroskop (LSM) 880 utrustad med en Airyscan detektor för att visualisera och lokalisera fluorescerande dextran på stereocilien och cellkroppen av auditiva hårceller.

Protocol

Djurskötseloch experimentella förfaranden utfördes enligt riktlinjerna för vård och användning av laboratoriedjur, som godkändes av Animal Care and Use Committee vid National Institute of Neurological Disorders and Stroke (Animal protocol #1336 till KJS). 1. Möss Ställ in ett par avelpar av C57BL/6J vildtyp för att häcka i djuranläggningen för att kontrollera datum för födelse av kullarna och hålla reda på åldern på valparna. 2. Coch…

Representative Results

Vi observerade robust och specifik märkning av hårceller efter 2h inkubation av organ av Korti utväxter från vild-typ postnatal-day-6 (P6) möss med 3 kDa dextran lysrör märkt med Texas Red (dextran-TR)(Figur 2A-B). Dextran märkning observerades i både inre och yttre hårceller (IHC och OHC) på basala, mellersta och apical regioner av organet i Corti(figur 2B). Fluorescerande märkt phalloidi…

Discussion

Detta protokoll beskriver hur man utför upptag experiment i murine organ Corti explants med 3 kDa dextran Texas Red. Målet med denna metod är att testa om molekyler större än andra tidigare testats också kunde specifikt märka hörselhårceller och genomsyra genom MET-kanalen. Liknande experimentella protokoll har tidigare använts för att utvärdera permeabiliteten hos hårceller till andra fluorescerande färgämnen som FM1-43 (0,56 kDa)12,19,…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi tackar Vincent Schram från NICHD mikroskopi och bildbehandling kärna för att bistå i confocal bild förvärv, och Tsg-Hui Chang för ovärderlig hjälp med koloni förvaltning och möss vård. Denna forskning stöddes av Intramural Research Program of the NINDS, NIH, Bethesda, MD, till K.J.S. A.B. stöddes av Intramural Research Program of the NINDS, NIH, och av en Robert Wenthold Postdoctoral Fellowship från intramural forskningsprogram av NIDCD.

Materials

#1.5 glass coverslips 18mm Warner Instruments 64-0714
Alexa Fluor 488 Phalloidin ThermoFisher A12379
Alexa Fluor 594 Phalloidin ThermoFisher A12381
alpha Plan-Apochromat 63X/1.4 Oil Corr M27 objective Carl Zeiss 420780-9970-000
Amiloride hydrochloride EMD MILLIPORE 129876
Benchwaver 3-dimensional Rocker Benchmarks scientific B3D5000
C57BL/6J wild-type mice strain 000664 The Jackson Laboratory
Cell impermeant BAPTA tetrapotassium salt ThermoFisher B1204
Dextran, Fluorescein, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable ThermoFisher D1820
Dextran, Texas Red, 10,000 MW, Lysine Fixable ThermoFisher D1863
Dextran, Texas Red, 3000 MW, Lysine Fixable ThermoFisher D3328
Formaldehyde Aqueous Solution EM Grade Electron microscopy science 15710
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red ThermoFisher 14025
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red ThermoFisher 14170
Image J or FIJI NIH http://fiji.sc/
Immersol 518F oil immersion media Carl Zeiss 444970-9000-000
Leibovitz's L-15 Medium, GlutaMAX Supplement ThermoFisher 31415029
neomycin trisulfate salt hydrate Sigma N6386
PBS (10X), pH 7.4 ThermoFisher 70011069
Phalloidin-CF405M Biotium 00034
ProLong Diamond antifade mounting media ThermoFisher P36970
superfrost plus microscope slide Fisherbrand 22-037-246
Triton X-100 Sigma T8787
Zen Black 2.3 SP1 software Carl Zeiss https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Furness, D. N., Hackney, C. M. . The Structure and Composition of the Stereociliary Bundle of Vertebrate Hair Cells. , (2006).
  2. Barr-Gillespie, P. G. Assembly of hair bundles, an amazing problem for cell biology. Molecular Biology of the Cell. 26 (15), 2727-2732 (2015).
  3. Shotwell, S. L., Jacobs, R., Hudspeth, A. J. Directional sensitivity of individual vertebrate hair cells to controlled deflection of their hair bundles. Annals of the New York Academy of Sciences. 374, 1-10 (1981).
  4. Fettiplace, R., Kim, K. X. The physiology of mechanoelectrical transduction channels in hearing. Physiological Reviews. 94 (3), 951-986 (2014).
  5. Fettiplace, R. Hair Cell Transduction, Tuning, and Synaptic Transmission in the Mammalian Cochlea. Comprehensive Physiology. 7 (4), 1197-1227 (2017).
  6. Corey, D. P., Hudspeth, A. J. Ionic basis of the receptor potential in a vertebrate hair cell. Nature. 281 (5733), 675-677 (1979).
  7. Beurg, M., Evans, M. G., Hackney, C. M., Fettiplace, R. A large-conductance calcium-selective mechanotransducer channel in mammalian cochlear hair cells. The Journal of Neuroscience. 26 (43), 10992-11000 (2006).
  8. Geleoc, G. S., Lennan, G. W., Richardson, G. P., Kros, C. J. A quantitative comparison of mechanoelectrical transduction in vestibular and auditory hair cells of neonatal mice. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 264 (1381), 611-621 (1997).
  9. Kros, C. J., Rusch, A., Richardson, G. P. Mechano-electrical transducer currents in hair cells of the cultured neonatal mouse cochlea. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 249 (1325), 185-193 (1992).
  10. Ohmori, H. Mechano-electrical transduction currents in isolated vestibular hair cells of the chick. The Journal of Physiology. 359, 189-217 (1985).
  11. Gale, J. E., Marcotti, W., Kennedy, H. J., Kros, C. J., Richardson, G. P. FM1-43 dye behaves as a permeant blocker of the hair-cell mechanotransducer channel. The Journal of Neuroscience. 21 (18), 7013-7025 (2001).
  12. Lelli, A., Asai, Y., Forge, A., Holt, J. R., Geleoc, G. S. Tonotopic gradient in the developmental acquisition of sensory transduction in outer hair cells of the mouse cochlea. Journal of Neurophysiology. 101 (6), 2961-2973 (2009).
  13. Alharazneh, A., et al. Functional hair cell mechanotransducer channels are required for aminoglycoside ototoxicity. PLoS One. 6 (7), 22347 (2011).
  14. Marcotti, W., van Netten, S. M., Kros, C. J. The aminoglycoside antibiotic dihydrostreptomycin rapidly enters mouse outer hair cells through the mechano-electrical transducer channels. The Journal of Physiology. 567, 505-521 (2005).
  15. Corns, L. F., Jeng, J. Y., Richardson, G. P., Kros, C. J., Marcotti, W. TMC2 Modifies Permeation Properties of the Mechanoelectrical Transducer Channel in Early Postnatal Mouse Cochlear Outer Hair Cells. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 326 (2017).
  16. Kawashima, Y., Kurima, K., Pan, B., Griffith, A. J., Holt, J. R. Transmembrane channel-like (TMC) genes are required for auditory and vestibular mechanosensation. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 467 (1), 85-94 (2015).
  17. Kim, K. X., Fettiplace, R. Developmental changes in the cochlear hair cell mechanotransducer channel and their regulation by transmembrane channel-like proteins. The Journal of General Physiology. 141 (1), 141-148 (2013).
  18. Kurima, K., et al. TMC1 and TMC2 Localize at the Site of Mechanotransduction in Mammalian Inner Ear Hair Cell Stereocilia. Cell Reports. 12 (10), 1606-1617 (2015).
  19. Pan, B., et al. TMC1 and TMC2 are components of the mechanotransduction channel in hair cells of the mammalian inner ear. Neuron. 79 (3), 504-515 (2013).
  20. Kawashima, Y., et al. Mechanotransduction in mouse inner ear hair cells requires transmembrane channel-like genes. Journal of Clinical Investigation. 121 (12), 4796-4809 (2011).
  21. Beurg, M., Goldring, A. C., Fettiplace, R. The effects of Tmc1 Beethoven mutation on mechanotransducer channel function in cochlear hair cells. The Journal of General Physiology. 146 (3), 233-243 (2015).
  22. Corns, L. F., Johnson, S. L., Kros, C. J., Marcotti, W. Tmc1 Point Mutation Affects Ca2+ Sensitivity and Block by Dihydrostreptomycin of the Mechanoelectrical Transducer Current of Mouse Outer Hair Cells. The Journal of Neuroscience. 36 (2), 336-349 (2016).
  23. Beurg, M., Fettiplace, R., Nam, J. H., Ricci, A. J. Localization of inner hair cell mechanotransducer channels using high-speed calcium imaging. Nature Neuroscience. 12 (5), 553-558 (2009).
  24. Maeda, R., et al. Tip-link protein protocadherin 15 interacts with transmembrane channel-like proteins TMC1 and TMC2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (35), 12907-12912 (2014).
  25. Assad, J. A., Shepherd, G. M., Corey, D. P. Tip-link integrity and mechanical transduction in vertebrate hair cells. Neuron. 7 (6), 985-994 (1991).
  26. Medrano-Soto, A., et al. Bioinformatic characterization of the Anoctamin Superfamily of Ca2+-activated ion channels and lipid scramblases. PLoS One. 13 (3), 0192851 (2018).
  27. Ballesteros, A., Fenollar-Ferrer, C., Swartz, K. J. Structural relationship between the putative hair cell mechanotransduction channel TMC1 and TMEM16 proteins. Elife. 7, (2018).
  28. Pan, B., et al. TMC1 Forms the Pore of Mechanosensory Transduction Channels in Vertebrate Inner Ear Hair Cells. Neuron. 99 (4), 736-753 (2018).
  29. Kitajiri, S., Makishima, T., Friedman, T. B., Griffith, A. J. A novel mutation at the DFNA36 hearing loss locus reveals a critical function and potential genotype-phenotype correlation for amino acid-572 of TMC1. Clinical Genetics. 71 (2), 148-152 (2007).
  30. Makishima, T., Kurima, K., Brewer, C. C., Griffith, A. J. Early onset and rapid progression of dominant nonsyndromic DFNA36 hearing loss. Otology & Neurotology. 25 (5), 714-719 (2004).
  31. Noguchi, Y., et al. Multiple quantitative trait loci modify cochlear hair cell degeneration in the Beethoven (Tmc1Bth) mouse model of progressive hearing loss DFNA36. Genetics. 173 (4), 2111-2119 (2006).
  32. Vreugde, S., et al. Beethoven, a mouse model for dominant, progressive hearing loss DFNA36. Nature Genetics. 30 (3), 257-258 (2002).
  33. Hulstrom, D., Svensjo, E. Intravital and electron microscopic study of bradykinin-induced vascular permeability changes using FITC-dextran as a tracer. The Journal of Pathology. 129 (3), 125-133 (1979).
  34. Mayhan, W. G., Heistad, D. D. Permeability of blood-brain barrier to various sized molecules. American Journal of Physiology. 248 (5), 712-718 (1985).
  35. Makarow, M. Endocytosis in Saccharomyces cerevisiae: internalization of alpha-amylase and fluorescent dextran into cells. The EMBO Journal. 4 (7), 1861-1866 (1985).
  36. Clayton, E. L., Cousin, M. A. Quantitative monitoring of activity-dependent bulk endocytosis of synaptic vesicle membrane by fluorescent dextran imaging. Journal of Neuroscience Methods. 185 (1), 76-81 (2009).
  37. Allman, B. L., Keniston, L. P., Meredith, M. A. Adult deafness induces somatosensory conversion of ferret auditory cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (14), 5925-5930 (2009).
  38. Warr, W. B., Boche, J. B., Neely, S. T. Efferent innervation of the inner hair cell region: origins and terminations of two lateral olivocochlear systems. Hearing Research. 108 (1-2), 89-111 (1997).
  39. Hu, B. H., Zheng, G. L. Membrane disruption: an early event of hair cell apoptosis induced by exposure to intense noise. Brain Research. 1239, 107-118 (2008).
  40. Zheng, G., Hu, B. H. Cell-cell junctions: a target of acoustic overstimulation in the sensory epithelium of the cochlea. BMC Neuroscience. 13, 71 (2012).
  41. Beurg, M., Nam, J. H., Chen, Q., Fettiplace, R. Calcium balance and mechanotransduction in rat cochlear hair cells. Journal of Neurophysiology. 104 (1), 18-34 (2010).
  42. Johnson, S. L., Beurg, M., Marcotti, W., Fettiplace, R. Prestin-driven cochlear amplification is not limited by the outer hair cell membrane time constant. Neuron. 70 (6), 1143-1154 (2011).
  43. Korobchevskaya, K., Lagerholm, B. C., Colin-York, H., Fritzsche, M. Exploring the Potential of Airyscan Microscopy for Live Cell Imaging. Photonics. 4 (3), (2017).
  44. Gil-Loyzaga, P., Brownell, W. E. Wheat germ agglutinin and Helix pomatia agglutinin lectin binding on cochlear hair cells. Hearing Research. 34 (2), 149-155 (1988).
  45. Santi, P. A., Anderson, C. B. Alcian blue staining of cochlear hair cell stereocilia and other cochlear tissues. Hearing Research. 23 (2), 153-160 (1986).
  46. Slepecky, N., Chamberlain, S. C. The cell coat of inner ear sensory and supporting cells as demonstrated by ruthenium red. Hearing Research. 17 (3), 281-288 (1985).
  47. Rusch, A., Kros, C. J., Richardson, G. P. Block by amiloride and its derivatives of mechano-electrical transduction in outer hair cells of mouse cochlear cultures. The Journal of Physiology. 474 (1), 75-86 (1994).
  48. Zhao, Y., Yamoah, E. N., Gillespie, P. G. Regeneration of broken tip links and restoration of mechanical transduction in hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (26), 15469-15474 (1996).
  49. Indzhykulian, A. A., et al. Molecular remodeling of tip links underlies mechanosensory regeneration in auditory hair cells. PLoS Biol. 11 (6), 1001583 (2013).
  50. Koivusalo, M., et al. Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling. Journal of Cell Biology. 188 (4), 547-563 (2010).
  51. West, M. A., Bretscher, M. S., Watts, C. Distinct endocytotic pathways in epidermal growth factor-stimulated human carcinoma A431 cells. Journal of Cell Biology. 109 (6), 2731-2739 (1989).
  52. Park, S., et al. tmie Is required for gentamicin uptake by the hair cells of mice. Comp Med. 63 (2), 136-142 (2013).
  53. Meyers, J. R., et al. Lighting up the senses: FM1-43 loading of sensory cells through nonselective ion channels. The Journal of Neuroscience. 23 (10), 4054-4065 (2003).
  54. Waguespack, J., Salles, F. T., Kachar, B., Ricci, A. J. Stepwise morphological and functional maturation of mechanotransduction in rat outer hair cells. The Journal of Neuroscience. 27 (50), 13890-13902 (2007).
  55. Beurg, M., et al. Variable number of TMC1-dependent mechanotransducer channels underlie tonotopic conductance gradients in the cochlea. Nature Communications. 9 (1), 2185 (2018).
  56. Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), e53561 (2016).
  57. Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research. Journal of Visualized Experiments. (124), e55704 (2017).
  58. May-Simera, H. Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea. Journal of Visualized Experiments. (108), e53559 (2016).
  59. Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic Culture of Neonatal Murine Inner Ear Explants. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170 (2019).
  60. Granath, K. A. Solution properties of branched dextrans. Journal of Colloid Science. 13 (4), 20 (1958).
  61. Molecular Probes, I.D.T. . Product information on Dextran Conjugates. , (2006).
  62. Korobchevskaya, K., Lagerholm, B. C., Colin-York, H., Fritzsche, M. Exploring the Potential of Airyscan Microscopy for Live Cell Imaging. Photonics. 4 (3), 41 (2017).

Tags

Dextran LabelingLive Hair CellsMechanotransduction ChannelsCochlear DissectionFluorescent Dextran

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Ballesteros, A., Swartz, K. J. Dextran Labeling and Uptake in Live and Functional Murine Cochlear Hair Cells. J. Vis. Exp. (156), e60769, doi:10.3791/60769 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image