JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Bioengineering

Dextran Merking og opptak i Live og funksjonell Murine Cochlear Hair Cells

Published: February 08, 2020
doi:
10.3791/60769
,
1Molecular Physiology and Biophysics Section,National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health

Summary

Her presenterer vi en metode for å visualisere opptaket av 3 kDa Texas Red-merket dextran i auditive hårceller med funksjonelle mechanotransduction kanaler. I tillegg kan dextrans på 3-10 kDa brukes til å studere endocytose i håret og støtte celler i orgelet Corti.

Abstract

Hårcellen mechanotransduction (MET) kanal spiller en viktig rolle i hørselen. Imidlertid forblir den molekylære identiteten og strukturelle informasjonen til MET ukjent. Elektrofysiologiske studier av hårceller viste at MET-kanalen har en stor ledning og er gjennomtrengelig for relativt store fluorescerende kationiske molekyler, inkludert noen styrylfargestoffer og Texas Red-merket aminoglykosid antibiotika. I denne protokollen beskriver vi en metode for å visualisere og evaluere opptaket av fluorescerende dekstrans i hårceller i organet corti planter som kan brukes til å analyse for funksjonelle MET-kanaler. Vi fant ut at 3 kDa Texas Red-merket dextran spesifikt merker funksjonelle auditive hårceller etter 1-2 h inkubasjon. Spesielt 3 kDa dextran etiketter de to kortere stereocilia rader og akkumuleres i cellekroppen i et diffust mønster når funksjonelle MET kanaler er til stede. Et ekstra vesicle-lignende mønster for merking ble observert i cellekroppen av hårceller og omkringliggende støtteceller. Våre data tyder på at 3 kDa Texas-Red dextran kan brukes til å visualisere og studere to veier for cellulær hellopptak; en hårcellespesifikk inngangsrute gjennom funksjonelle MET-kanaler og endocytose, et mønster som også er tilgjengelig for større dextran.

Introduction

Hårcellene i det indre øret er sensoriske celler som oppdager lyd og skjulte de mekanisk stimuli i elektriske signaler, som til slutt tolkes av hjernen vår. Disse cellene har en trappformet bunt av tre rader med actin-baserte filamenter, kjent som stereocilia, som stikker ut fra deres apikale region1,2. De mekaniske stimuli avlede stereocilia filamenter mot den lengste raden og utløse åpningen av mechanotransduction (MET) kanaler3. Åpningen av MET-kanalene fører til en tilstrømning av kationer som depolariserer cellen og signaliserer dermed frigjøring av synapsevesikler i hårcellens basalområde.

De biofysiske egenskapene til MET-kanalen som er avgjørende for hørselen, har blitt mye preget. Blant andre egenskaper er disse kanalene kationiske selektive og har en relativt stor ledning (150–300 pS i lav Ca2 +)4,5,6,7,8,9,10. Bemerkelsesverdig, store fluorescerende molekyler som FM1-43 og Texas Red-merket aminoglykosider er permente blokkere av MET-kanalen, noe som resulterer i akkumulering i håret cellekroppen som kan visualiseres ved hjelp av fluorescens mikroskopi11,12,13,14. Omvendt har den molekylære identiteten og strukturen til MET-kanalen og dens permeasjonsvei vært unnvikende. Økende eksperimentelle bevis indikerer at transmembrane-lignende kanal protein 1 (TMC1) er en del av MET-kanalen i modne hårceller15,16,17,18,19. Mutasjoner i transmembrane-lignende kanal 1 (TMC1) endre MET kanal egenskaper19,20,21,22 og forårsake døvhet. I tillegg lokaliserer TMC1 til stedet for MET-kanalen18,23 og samhandler med tips-linken som er ansvarlig for å overføre den mekaniske kraften til MET-kanalen24,25. Videre har nyere bioinformatikkanalyse identifisert TMC-proteinene som evolusjonære relatert til mechanosensitive kanaler TMEM63/OSCA proteiner og TMEM16 proteiner, en familie av kalsiumaktiverte klorid kanaler og lipid scramblases26,27,28. En strukturell modell av TMC1 basert på forholdet mellom disse proteinene avslørte tilstedeværelsen av et stort hulrom ved protein-lipid-grensesnittet27. Dette hulrommet har de to TMC1 mutasjoner som forårsaker autosomal dominerende hørselstap (DFNA36)27,29,30,31,32, og selektiv modifisering av cysteinmutanter for rester i hulrommet endre MET kanalegenskaper28, noe som indikerer at det kan fungere som permeation banen til MET-kanalen. Den store størrelsen på dette spådde hulrommet i TMC-proteiner kan forklare evnen til store molekyler til å gjennomsyre MET-kanalen. For å teste spådommen om at MET-kanalen inneholder en uvanlig stor permeasjonsvei og for å presse grensene for størrelsen på hulrommet observert i TMC1, utviklet vi en protokoll for å utføre opptakseksperimenter i orgelet corti explants med et større molekyl, 3 kDa dextran fluorescerende merket med Texas Red.

Dextran er et komplekst forgrenet polysakkarid bestående av mange D-glukosemolekyler bundet av alfa-1,6 glykosidiske koblinger. Denhøye løseligheten i vann, lav celletoksisitet og bioinertitet gjør det til et allsidig verktøy for å studere flere cellulære prosesser. I tillegg er dextran tilgjengelig i et bredt spekter av størrelser og fluorescerende merket med fluoropforer av flere farger. Fluorescerende merket dextrans brukes vanligvis i celle- og vevpermeabilitetsforskning33,34, for å studere endocytose i flere cellulære systemer35,36, og for neural sporing37,38. I hørselsfeltet har dextran molekyler også blitt brukt til å vurdere forstyrrelsen av cellecellekrysset og tap av auditiv sensorisk epitelintegritet etter eksponering for intens støy i chinchillaorganet Corti39,40.

I dette arbeidet utnyttet vi egenskapene til noen av de minste (3 og 10 kDa) fluorescerende dextrans for å utføre opptakseksperimenter i murine indre øre hårceller og utforske størrelsen på permeasjonsbanen til den indre ørehårcellen MET kanal. I tillegg brukte vi et laserskannings konfokalmikroskop (LSM) 880 utstyrt med en Airyscan-detektor for å visualisere og lokalisere fluorescerende dextran ved stereocilia og cellekroppen av auditive hårceller.

Protocol

Dyrepleie og eksperimentelle prosedyrer ble utført etter retningslinjene for pleie og bruk av laboratoriedyr, som ble godkjent av Animal Care and Use Committee ved National Institute of Neurological Disorders and Stroke (Animal protocol #1336 til KJS). 1. Mus Sett et par avl par Avl par Avl par C57BL/6J villtype å avle i dyreanlegget for å kontrollere fødselsdatoen til kullene og holde styr på alderen på valpene. 2. Cochleae disseksjon <l…

Representative Results

Vi observerte robust og spesifikk merking av hårceller etter 2h inkubasjon av organ av Corti explants fra vill-type postnatal-dag-6 (P6) mus med 3 kDa dextran fluorescerende merket med Texas Red (dextran-TR) (Figur 2A-B). Dextran merking ble observert i både indre og ytre hårceller (IHC og OHC) på basal, midten og apikale regioner i orgelet Corti (Figur 2B). Fluorescerende merket phalloidin ble br…

Discussion

Denne protokollen beskriver hvordan man utfører opptakseksperimenter i murine organ av Corti explants med 3 kDa dextran Texas Red. Målet med denne metoden er å teste om molekyler større enn andre tidligere testet også var i stand til å spesifikt merke auditive hårceller og gjennomsyre gjennom MET-kanalen. Lignende eksperimentelle protokoller har tidligere blitt brukt til å evaluere permeabiliteten av hårceller til andre fluorescerende fargestoffer som FM1-43 (0,56 kDa)12,<sup c…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker Vincent Schram fra NICHD mikroskopi og bildekjerne for å bistå i confocal bildeoppkjøpet, og Tsg-Hui Chang for uvurderlig hjelp med kolonihåndtering og musomsorg. Denne forskningen ble støttet av Intramural Research Program of the NINDS, NIH, Bethesda, MD, til K.J.S. A.B. ble støttet av Intramural Research Program of the NINDS, NIH, og av en Robert Wenthold Postdoctoral Fellowship fra intramural forskningsprogram av NIDCD.

Materials

#1.5 glass coverslips 18mm Warner Instruments 64-0714
Alexa Fluor 488 Phalloidin ThermoFisher A12379
Alexa Fluor 594 Phalloidin ThermoFisher A12381
alpha Plan-Apochromat 63X/1.4 Oil Corr M27 objective Carl Zeiss 420780-9970-000
Amiloride hydrochloride EMD MILLIPORE 129876
Benchwaver 3-dimensional Rocker Benchmarks scientific B3D5000
C57BL/6J wild-type mice strain 000664 The Jackson Laboratory
Cell impermeant BAPTA tetrapotassium salt ThermoFisher B1204
Dextran, Fluorescein, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable ThermoFisher D1820
Dextran, Texas Red, 10,000 MW, Lysine Fixable ThermoFisher D1863
Dextran, Texas Red, 3000 MW, Lysine Fixable ThermoFisher D3328
Formaldehyde Aqueous Solution EM Grade Electron microscopy science 15710
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red ThermoFisher 14025
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red ThermoFisher 14170
Image J or FIJI NIH http://fiji.sc/
Immersol 518F oil immersion media Carl Zeiss 444970-9000-000
Leibovitz's L-15 Medium, GlutaMAX Supplement ThermoFisher 31415029
neomycin trisulfate salt hydrate Sigma N6386
PBS (10X), pH 7.4 ThermoFisher 70011069
Phalloidin-CF405M Biotium 00034
ProLong Diamond antifade mounting media ThermoFisher P36970
superfrost plus microscope slide Fisherbrand 22-037-246
Triton X-100 Sigma T8787
Zen Black 2.3 SP1 software Carl Zeiss https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Furness, D. N., Hackney, C. M. . The Structure and Composition of the Stereociliary Bundle of Vertebrate Hair Cells. , (2006).
  2. Barr-Gillespie, P. G. Assembly of hair bundles, an amazing problem for cell biology. Molecular Biology of the Cell. 26 (15), 2727-2732 (2015).
  3. Shotwell, S. L., Jacobs, R., Hudspeth, A. J. Directional sensitivity of individual vertebrate hair cells to controlled deflection of their hair bundles. Annals of the New York Academy of Sciences. 374, 1-10 (1981).
  4. Fettiplace, R., Kim, K. X. The physiology of mechanoelectrical transduction channels in hearing. Physiological Reviews. 94 (3), 951-986 (2014).
  5. Fettiplace, R. Hair Cell Transduction, Tuning, and Synaptic Transmission in the Mammalian Cochlea. Comprehensive Physiology. 7 (4), 1197-1227 (2017).
  6. Corey, D. P., Hudspeth, A. J. Ionic basis of the receptor potential in a vertebrate hair cell. Nature. 281 (5733), 675-677 (1979).
  7. Beurg, M., Evans, M. G., Hackney, C. M., Fettiplace, R. A large-conductance calcium-selective mechanotransducer channel in mammalian cochlear hair cells. The Journal of Neuroscience. 26 (43), 10992-11000 (2006).
  8. Geleoc, G. S., Lennan, G. W., Richardson, G. P., Kros, C. J. A quantitative comparison of mechanoelectrical transduction in vestibular and auditory hair cells of neonatal mice. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 264 (1381), 611-621 (1997).
  9. Kros, C. J., Rusch, A., Richardson, G. P. Mechano-electrical transducer currents in hair cells of the cultured neonatal mouse cochlea. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 249 (1325), 185-193 (1992).
  10. Ohmori, H. Mechano-electrical transduction currents in isolated vestibular hair cells of the chick. The Journal of Physiology. 359, 189-217 (1985).
  11. Gale, J. E., Marcotti, W., Kennedy, H. J., Kros, C. J., Richardson, G. P. FM1-43 dye behaves as a permeant blocker of the hair-cell mechanotransducer channel. The Journal of Neuroscience. 21 (18), 7013-7025 (2001).
  12. Lelli, A., Asai, Y., Forge, A., Holt, J. R., Geleoc, G. S. Tonotopic gradient in the developmental acquisition of sensory transduction in outer hair cells of the mouse cochlea. Journal of Neurophysiology. 101 (6), 2961-2973 (2009).
  13. Alharazneh, A., et al. Functional hair cell mechanotransducer channels are required for aminoglycoside ototoxicity. PLoS One. 6 (7), 22347 (2011).
  14. Marcotti, W., van Netten, S. M., Kros, C. J. The aminoglycoside antibiotic dihydrostreptomycin rapidly enters mouse outer hair cells through the mechano-electrical transducer channels. The Journal of Physiology. 567, 505-521 (2005).
  15. Corns, L. F., Jeng, J. Y., Richardson, G. P., Kros, C. J., Marcotti, W. TMC2 Modifies Permeation Properties of the Mechanoelectrical Transducer Channel in Early Postnatal Mouse Cochlear Outer Hair Cells. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 326 (2017).
  16. Kawashima, Y., Kurima, K., Pan, B., Griffith, A. J., Holt, J. R. Transmembrane channel-like (TMC) genes are required for auditory and vestibular mechanosensation. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 467 (1), 85-94 (2015).
  17. Kim, K. X., Fettiplace, R. Developmental changes in the cochlear hair cell mechanotransducer channel and their regulation by transmembrane channel-like proteins. The Journal of General Physiology. 141 (1), 141-148 (2013).
  18. Kurima, K., et al. TMC1 and TMC2 Localize at the Site of Mechanotransduction in Mammalian Inner Ear Hair Cell Stereocilia. Cell Reports. 12 (10), 1606-1617 (2015).
  19. Pan, B., et al. TMC1 and TMC2 are components of the mechanotransduction channel in hair cells of the mammalian inner ear. Neuron. 79 (3), 504-515 (2013).
  20. Kawashima, Y., et al. Mechanotransduction in mouse inner ear hair cells requires transmembrane channel-like genes. Journal of Clinical Investigation. 121 (12), 4796-4809 (2011).
  21. Beurg, M., Goldring, A. C., Fettiplace, R. The effects of Tmc1 Beethoven mutation on mechanotransducer channel function in cochlear hair cells. The Journal of General Physiology. 146 (3), 233-243 (2015).
  22. Corns, L. F., Johnson, S. L., Kros, C. J., Marcotti, W. Tmc1 Point Mutation Affects Ca2+ Sensitivity and Block by Dihydrostreptomycin of the Mechanoelectrical Transducer Current of Mouse Outer Hair Cells. The Journal of Neuroscience. 36 (2), 336-349 (2016).
  23. Beurg, M., Fettiplace, R., Nam, J. H., Ricci, A. J. Localization of inner hair cell mechanotransducer channels using high-speed calcium imaging. Nature Neuroscience. 12 (5), 553-558 (2009).
  24. Maeda, R., et al. Tip-link protein protocadherin 15 interacts with transmembrane channel-like proteins TMC1 and TMC2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (35), 12907-12912 (2014).
  25. Assad, J. A., Shepherd, G. M., Corey, D. P. Tip-link integrity and mechanical transduction in vertebrate hair cells. Neuron. 7 (6), 985-994 (1991).
  26. Medrano-Soto, A., et al. Bioinformatic characterization of the Anoctamin Superfamily of Ca2+-activated ion channels and lipid scramblases. PLoS One. 13 (3), 0192851 (2018).
  27. Ballesteros, A., Fenollar-Ferrer, C., Swartz, K. J. Structural relationship between the putative hair cell mechanotransduction channel TMC1 and TMEM16 proteins. Elife. 7, (2018).
  28. Pan, B., et al. TMC1 Forms the Pore of Mechanosensory Transduction Channels in Vertebrate Inner Ear Hair Cells. Neuron. 99 (4), 736-753 (2018).
  29. Kitajiri, S., Makishima, T., Friedman, T. B., Griffith, A. J. A novel mutation at the DFNA36 hearing loss locus reveals a critical function and potential genotype-phenotype correlation for amino acid-572 of TMC1. Clinical Genetics. 71 (2), 148-152 (2007).
  30. Makishima, T., Kurima, K., Brewer, C. C., Griffith, A. J. Early onset and rapid progression of dominant nonsyndromic DFNA36 hearing loss. Otology & Neurotology. 25 (5), 714-719 (2004).
  31. Noguchi, Y., et al. Multiple quantitative trait loci modify cochlear hair cell degeneration in the Beethoven (Tmc1Bth) mouse model of progressive hearing loss DFNA36. Genetics. 173 (4), 2111-2119 (2006).
  32. Vreugde, S., et al. Beethoven, a mouse model for dominant, progressive hearing loss DFNA36. Nature Genetics. 30 (3), 257-258 (2002).
  33. Hulstrom, D., Svensjo, E. Intravital and electron microscopic study of bradykinin-induced vascular permeability changes using FITC-dextran as a tracer. The Journal of Pathology. 129 (3), 125-133 (1979).
  34. Mayhan, W. G., Heistad, D. D. Permeability of blood-brain barrier to various sized molecules. American Journal of Physiology. 248 (5), 712-718 (1985).
  35. Makarow, M. Endocytosis in Saccharomyces cerevisiae: internalization of alpha-amylase and fluorescent dextran into cells. The EMBO Journal. 4 (7), 1861-1866 (1985).
  36. Clayton, E. L., Cousin, M. A. Quantitative monitoring of activity-dependent bulk endocytosis of synaptic vesicle membrane by fluorescent dextran imaging. Journal of Neuroscience Methods. 185 (1), 76-81 (2009).
  37. Allman, B. L., Keniston, L. P., Meredith, M. A. Adult deafness induces somatosensory conversion of ferret auditory cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (14), 5925-5930 (2009).
  38. Warr, W. B., Boche, J. B., Neely, S. T. Efferent innervation of the inner hair cell region: origins and terminations of two lateral olivocochlear systems. Hearing Research. 108 (1-2), 89-111 (1997).
  39. Hu, B. H., Zheng, G. L. Membrane disruption: an early event of hair cell apoptosis induced by exposure to intense noise. Brain Research. 1239, 107-118 (2008).
  40. Zheng, G., Hu, B. H. Cell-cell junctions: a target of acoustic overstimulation in the sensory epithelium of the cochlea. BMC Neuroscience. 13, 71 (2012).
  41. Beurg, M., Nam, J. H., Chen, Q., Fettiplace, R. Calcium balance and mechanotransduction in rat cochlear hair cells. Journal of Neurophysiology. 104 (1), 18-34 (2010).
  42. Johnson, S. L., Beurg, M., Marcotti, W., Fettiplace, R. Prestin-driven cochlear amplification is not limited by the outer hair cell membrane time constant. Neuron. 70 (6), 1143-1154 (2011).
  43. Korobchevskaya, K., Lagerholm, B. C., Colin-York, H., Fritzsche, M. Exploring the Potential of Airyscan Microscopy for Live Cell Imaging. Photonics. 4 (3), (2017).
  44. Gil-Loyzaga, P., Brownell, W. E. Wheat germ agglutinin and Helix pomatia agglutinin lectin binding on cochlear hair cells. Hearing Research. 34 (2), 149-155 (1988).
  45. Santi, P. A., Anderson, C. B. Alcian blue staining of cochlear hair cell stereocilia and other cochlear tissues. Hearing Research. 23 (2), 153-160 (1986).
  46. Slepecky, N., Chamberlain, S. C. The cell coat of inner ear sensory and supporting cells as demonstrated by ruthenium red. Hearing Research. 17 (3), 281-288 (1985).
  47. Rusch, A., Kros, C. J., Richardson, G. P. Block by amiloride and its derivatives of mechano-electrical transduction in outer hair cells of mouse cochlear cultures. The Journal of Physiology. 474 (1), 75-86 (1994).
  48. Zhao, Y., Yamoah, E. N., Gillespie, P. G. Regeneration of broken tip links and restoration of mechanical transduction in hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (26), 15469-15474 (1996).
  49. Indzhykulian, A. A., et al. Molecular remodeling of tip links underlies mechanosensory regeneration in auditory hair cells. PLoS Biol. 11 (6), 1001583 (2013).
  50. Koivusalo, M., et al. Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling. Journal of Cell Biology. 188 (4), 547-563 (2010).
  51. West, M. A., Bretscher, M. S., Watts, C. Distinct endocytotic pathways in epidermal growth factor-stimulated human carcinoma A431 cells. Journal of Cell Biology. 109 (6), 2731-2739 (1989).
  52. Park, S., et al. tmie Is required for gentamicin uptake by the hair cells of mice. Comp Med. 63 (2), 136-142 (2013).
  53. Meyers, J. R., et al. Lighting up the senses: FM1-43 loading of sensory cells through nonselective ion channels. The Journal of Neuroscience. 23 (10), 4054-4065 (2003).
  54. Waguespack, J., Salles, F. T., Kachar, B., Ricci, A. J. Stepwise morphological and functional maturation of mechanotransduction in rat outer hair cells. The Journal of Neuroscience. 27 (50), 13890-13902 (2007).
  55. Beurg, M., et al. Variable number of TMC1-dependent mechanotransducer channels underlie tonotopic conductance gradients in the cochlea. Nature Communications. 9 (1), 2185 (2018).
  56. Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), e53561 (2016).
  57. Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research. Journal of Visualized Experiments. (124), e55704 (2017).
  58. May-Simera, H. Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea. Journal of Visualized Experiments. (108), e53559 (2016).
  59. Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic Culture of Neonatal Murine Inner Ear Explants. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170 (2019).
  60. Granath, K. A. Solution properties of branched dextrans. Journal of Colloid Science. 13 (4), 20 (1958).
  61. Molecular Probes, I.D.T. . Product information on Dextran Conjugates. , (2006).
  62. Korobchevskaya, K., Lagerholm, B. C., Colin-York, H., Fritzsche, M. Exploring the Potential of Airyscan Microscopy for Live Cell Imaging. Photonics. 4 (3), 41 (2017).

Tags

Dextran LabelingLive Hair CellsMechanotransduction ChannelsCochlear DissectionFluorescent Dextran
check_url/60769?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Ballesteros, A., Swartz, K. J. Dextran Labeling and Uptake in Live and Functional Murine Cochlear Hair Cells. J. Vis. Exp. (156), e60769, doi:10.3791/60769 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image