طريقة سريعة لتصوير الفلورسينس متعدد الأطياف لأقسام الأنسجة المجمدة
Summary
نحن نصف طريقة تلطيخ سريعة لإجراء التصوير متعدد الأطياف على الأنسجة المجمدة.
Abstract
يتيح التصوير الفلوري المتعدد الأطياف على أنسجة البارافين المضمنة (FFPE) ذات البارافين ذات البارافين (FFPE) الكشف عن علامات متعددة في عينة نسيج واحد يمكن أن توفر معلومات حول التعبير المشترك للمستضد والتوزيع المكاني للعلامات. ومع ذلك، قد يؤدي عدم وجود أجسام مضادة مناسبة للأنسجة الثابتة الشكلية إلى تقييد طبيعة العلامات التي يمكن اكتشافها. بالإضافة إلى ذلك ، فإن طريقة تلطيخ تستغرق وقتًا طويلاً. هنا نصف طريقة سريعة لإجراء التصوير الفلوري متعدد الأطياف على الأنسجة المجمدة. وتشمل هذه الطريقة تركيبات الفلوروفور المستخدمة، والخطوات التفصيلية لتلطيخ الأنسجة المجمدة الماوس والإنسان، والمسح الضوئي، واقتناء، وإجراءات التحليل. لتحليل تلطيخ، يتم استخدام نظام التصوير متعدد الأطياف المتاحة تجاريا ً. من خلال هذه الطريقة ، تم تلطيخ ما يصل إلى ست علامات مختلفة واكتشافها في قسم واحد من الأنسجة المجمدة. يمكن لبرنامج تحليل التعلم الآلي أن يُستخدم في الخلايا الظاهرية التي يمكن استخدامها للتحليل الكمي. الطريقة الموصوفة هنا للأنسجة المجمدة مفيدة للكشف عن العلامات التي لا يمكن اكتشافها في أنسجة FFPE أو التي لا تتوفر الأجسام المضادة لأنسجة FFPE.
Introduction
وقد أدت التطورات الأخيرة في تقنيات التصوير المجهري إلى تحسين معرفتنا وفهمنا للعمليات البيولوجية وحالات المرض بشكل كبير. في الموقع الكشف عن البروتينات في الأنسجة عن طريق الكيمياء المناعية الكروميوم (IHC) يتم بشكل روتيني في علم الأمراض. ومع ذلك ، فإن الكشف عن علامات متعددة باستخدام تلطيخ Chromogenic IHC يشكلتحديًا 1 ويتم تطوير طرق أحدث لاستخدام أساليب تلطيخ الفلور المناعي (mIF) متعددة ، حيث يتم وضع علامات بيولوجية متعددة على عينة نسيج واحد. الكشف عن علامات بيولوجية متعددة مفيد، لأن المعلومات المتعلقة بهندسة الأنسجة، والتوزيع المكاني للخلايا، والتعبير المشترك للمستضد يتم التقاطها جميعها في عينة نسيج واحد2. وقد جعل استخدام تكنولوجيا التصوير الفلورية المتعددة الأطياف الكشف عن علامات بيولوجية متعددة ممكناً. في هذه التكنولوجيا، وذلك باستخدام بصريات محددة يمكن فصل أطياف الفلورسينس لكل فلوروفور الفردية أو “غير مختلطة”، مما يتيح الكشف عن علامات متعددة دون أي تقاطع الطيفية3. التصوير الفلوري متعدد الأطياف أصبح نهجا حاسما في بيولوجيا الخلايا، وتطوير الأدوية قبل السريرية، وعلم الأمراض السريرية، والورم المناعة التنميط4،5،6. الأهم من ذلك، يمكن أن يكون التوزيع السباسي للخلايا المناعية (على وجه التحديد خلايا CD8 T) بمثابة عامل تشخيصي للمرضى الذين يعانون من الأورام الموجودة7.
وقد وضعت أساليب مختلفة لتلطيخ الفلورسين المتعدد ويمكن القيام به إما في وقت واحد أو بالتسلسل. في طريقة تلطيخ في وقت واحد، يتم إضافة جميع الأجسام المضادة معا ككوكتيل في خطوة واحدة لتسمية الأنسجة. تستخدم تقنية UltraPlex مزيجًا من الأجسام المضادة الأولية النتنة متبوعة يليها مزيج من الأجسام المضادة الثانوية المضادة للنتن المترافقة مع الفلوروفور. InSituPlex التكنولوجيا8 يستخدم مزيجا من الأجسام المضادة الفريدة الحمض النووي الاقتران الأولية التي تضاف في وقت واحد إلى الأنسجة تليها خطوة التضخيم وأخيرا المخارج الفلوروفور مترافق التي هي مكملة لكل تسلسل الحمض النووي فريدة من نوعها على الأجسام المضادة الأولية. كل من هذه التكنولوجيات تمكن من الكشف عن أربع علامات بالإضافة إلى 4’،6-diamino-2-phenylindole (DAPI) للتلطيخ النووي. ويستند نهجين آخرين لتلطيخ متعددة في وقت واحد على الطيف كتلة الأيون الثانوية9. يستخدم نظام التصوير Hyperion قياس الخلايا الشامل التصوير10 للكشف عن ما يصل إلى 37 علامة. تستخدم هذه التقنية مزيجًا من الأجسام المضادة المعدنية المترافقة لتلطيخ الأنسجة ، ويتم تشعب مناطق محددة من الأنسجة بالليزر ونقلها إلى مقياس سيتومتر جماعي حيث يتم اكتشاف الأيونات المعدنية. آخر مماثلة التكنولوجيا هو IONPath، الذي يستخدم متعددة الأيون شعاع تكنولوجيا التصوير11. تستخدم هذه التقنية أداة قياس الطيف الكتلي المعدلة ومصدر أيون الأكسجين بدلاً من الليزر لإزالة الأجسام المضادة المعدنية المترافقة. في حين أن كل هذه النهج المتعددة المتزامنة تلطيخ تمكين الكشف عن علامات متعددة، لا يمكن التقليل من التكاليف التي ينطوي عليها لاقتران الحمض النووي، التعاز، أو المعادن إلى الأجسام المضادة، وفقدان الأنسجة بسبب الاجتثاث، ومعالجة الصور واسعة النطاق لعدم الاختلاط. وعلاوة على ذلك، لا تتوفر حاليا ً مجموعات وبروتوكولات تلطيخ إلا لأنسجة FFPE وينطوي تطوير لوحات مخصصة على وقت ونفقات إضافية.
طريقة تلطيخ متعددة متتابعة، في المقابل، تشمل وضع علامة على الأنسجة مع الأجسام المضادة لعلامة واحدة، وتجريد لإزالة الأجسام المضادة، تليها تكرار متتابعة لهذه العملية لتسمية علامات متعددة12. إن تضخيم إشارة التيراميد (TSA) هو الأسلوب متعدد الإرسال التسلسلي الأكثر استخدامًا. تستخدم اثنين من التقنيات متعددة أخرى متعددة مزيج من أساليب تلطيخ متزامنة ومتتابعة. تستخدم منصة CODEX13 مزيجًا من الأجسام المضادة المترافقة مع تسلسلoligonucleotide النووي الفريد الذي يتم تصنيفه في نهاية المطاف بفلوريفوروفور باستخدام خطوة بلمرة مفهرسة يتبعها التصوير والتجريد وتكرار العملية للكشف عن ما يصل إلى 50 علامة. نهج تلطيخ MultiOmyx متعددة14 هو تكرار للتلطيخ مع مزيج من ثلاثة إلى أربعة الأجسام المضادة المفلورة الزوجية ، والتصوير ، وإرواء الفلوروفوريات ، وتكرار هذه الدورة للكشف عن ما يصل إلى 60 علامة على مقطع واحد. على غرار طريقة تلطيخ متعددة في وقت واحد ، في حين يمكن الكشف عن مجموعة واسعة من العلامات ، فإن الوقت الذي ينطوي عليه تلطيخ ، وحيازة الصور ، والمعالجة ، والتحليل واسع النطاق. تتضمن خطوة التجريد /التروية التدفئة و / أو تبييض عينة الأنسجة ، وبالتالي ، يتم تنفيذ نهج تلطيخ متعدد الموجات المتسلسلة عادة على أنسجة FFPE التي تحافظ على سلامة الأنسجة عند التدفئة أو التبييض.
يتم تنفيذ التثبيت الرسمي وتضمين البارافين اللاحق بسهولة في بيئة سريرية ، وكتل الأنسجة سهلة التخزين ، وتتوفر العديد من بروتوكولات تلطيخ متعددة. ومع ذلك ، فإن معالجة وتضمين وإزالة الأنسجة FFPE ، وكذلك استرجاع المستضد15، وهي عملية يمكن من خلالها للأجسام المضادة الوصول بشكل أفضل إلى epitopes ، تستغرق وقتًا طويلاً. وعلاوة على ذلك، فإن المعالجة التي تنطوي عليها أنسجة FFPE يساهم في autofluorescence16 والأقنعة الهدف epitopes، مما أدى إلى تقلب وعدم وجود استنساخ الأجسام المضادة المتاحة للكشف عن المستضدات في أنسجة FFPE17،18،19. مثال على ذلك هو مستضد الكريات البيض البشرية (HLA) فئة I alleles20. في المقابل، لا ينطوي التجميد المفاجئة للأنسجة على خطوات معالجة واسعة النطاق قبل أو بعد التثبيت، والتحايل على الحاجة إلى استرجاع المستضد21،22، وجعله مفيدًا للكشف عن نطاق أوسع من الأهداف. لذلك ، يمكن أن يكون استخدام الأنسجة المجمدة لتصوير الفلورسينس متعدد الأطياف قيمًا للكشف عن أهداف الدراسات قبل السريرية والسريرية.
وبالنظر إلى القيود المذكورة أعلاه عند استخدام أنسجة FFPE، سألنا عما إذا كان يمكن إجراء التصوير الفلوري المتعدد الأطياف على الأنسجة المجمدة. لمعالجة هذا السؤال، اختبرنا طريقة تلطيخ متعددة في وقت واحد باستخدام لوحة من الأجسام المضادة المفلورة الزوجية للكشف عن مستضدات متعددة وحللنا تلطيخ باستخدام نظام تصوير متعدد الأطياف الآلية. تمكنا من تلطيخ ما يصل إلى ست علامات في قسم نسيج واحد في غضون 90 دقيقة.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد استخدمت الأنسجة المجمدة على نطاق واسع لتصوير mIF للكشف تقليديا ثلاث إلى أربع علامات31 على الأنسجة باستخدام الطريقة المباشرة وغير المباشرة32. في الطريقة المباشرة ، يتم اقتران الأجسام المضادة بالأصباغ المفلورة أو النقاط الكمية33 لتسمية الأنسجة ، بين…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم توفير التوجيه التصويري والتحليل من قبل مركز موارد البحوث – علم الأنسجة البحثي ومختبر تصوير الأنسجة الأساسية في جامعة إلينوي في شيكاغو التي أنشئت بدعم من مكتب نائب رئيس الجامعة للبحوث. تم دعم العمل من قبل المعاهد القومية للصحة / NCI RO1CA191317 إلى CLP ، من قبل المعاهد القومية للصحة / NIAMS (منحة SBDRC 1P30AR075049-01) إلى الدكتور A. Paller ، وبدعم من مركز روبرت H. Lurie الشامل للسرطان إلى مركز تقييم المناعة في جامعة نورث وسترن.
Materials
| Acetone (histological grade) | Fisher Scientific | A16F-1GAL | Fixing tissues |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 | BioLegend | 100212 | Clone – 17A2; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 488, eBioscience anti-human CD20 | ThermoFisher Scientific | 53-0202-82 | Clone – L26; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 555 Mouse anti-Ki-67 | BD Biosciences | 558617 | Primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 594 anti-human CD3 | BioLegend | 300446 | Clone – UCHT1; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 594 anti-mouse CD8a | BioLegend | 100758 | Clone – 53-6.7; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 647 anti-human CD8a | BioLegend | 372906 | Clone – C8/144B; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse CD206 (MMR) | BioLegend | 141711 | Clone – C068C2; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse CD4 Antibody | BioLegend | 100426 | Clone – GK1.5; primary conjugated antibody |
| C57BL/6 Mouse | Charles River Laboratories | 27 | Mouse frozen tissues used for multispectral training |
| Coplin Jar | Sigma Aldrich | S6016-6EA | Rehydrating and washing slides |
| DAPI Solution | BD Biosciences | 564907 | Nucleic Acid stain |
| Diamond White Glass Charged Slides | DOT Scientific | DW7590W | Adhering tissue sections |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x (without Ca and Mg) | Fisher Scientific | MT21031CV | Washing and diluent |
| Gold Seal Cover Slips | ThermoFisher Scientific | 3306 | Protecting stained tissues |
| Human Normal Tonsil OCT frozen tissue block | AMSBio | AMS6023 | Human frozen tissue used for multispectral staining |
| Human Serum 1X | Gemini Bio-Products | 100-512 | Blocking and diluent for human tissues |
| inForm | Akoya Biosciences | Version 2.4.1 | Machine learning software |
| PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD4 | BioLegend | 300529 | Clone – RPA-T4; primary conjugated antibody |
| PerCP-Cy 5.5 Rat Anti-CD11b | BD Biosciences | 550993 | Clone – M1/70; primary conjugated antibody |
| Phenochart | Akoya Biosciences | Version 1.0.8 | Whole slide scan software |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36965 | Mounting medium |
| Research Cryostat | Leica Biosystems | CM3050 S | Sectioning tissues |
| Superblock 1X | ThermoFisher Scientific | 37515 | Blocking mouse tissues |
| Tissue-Tek O.C.T Solution | Sakura Finetek | 4583 | Embedding tissues |
| Vectra 3.0 Automated Quantitative Pathology Imaging System, 6 Slide | Akoya Biosciences | CLS142568 | Semi-automated multispectral imaging system |
| Vectra Software | Akoya Biosciences | Version 3.0.5 | Software to operate microscope |
References
- van der Loos, C. M. Chromogens in Multiple Immunohistochemical Staining Used for Visual Assessment and Spectral Imaging: The Colorful Future. Journal of Histotechnology. 33 (1), 31-40 (2010).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Bian, L., et al. Multispectral imaging using a single bucket detector. Scientific Reports. 6, 24752 (2016).
- Zhou, L., El-Deiry, W. S. Multispectral fluorescence imaging. Journal of Nuclear Medicine. 50 (10), 1563-1566 (2009).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Wickenhauser, C., Pico de Coaña, Y., et al. . Immune Checkpoint Blockade: Methods and Protocols. , 13-31 (2019).
- Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 3 (1), 47 (2015).
- Manesse, M., Patel, K. K., Bobrow, M., Downing, S. R. The InSituPlex((R)) Staining Method for Multiplexed Immunofluorescence Cell Phenotyping and Spatial Profiling of Tumor FFPE Samples. Methods in Molecular Biology. 2055, 585-592 (2020).
- Gamble, L. J., Anderton, C. R. Secondary Ion Mass Spectrometry Imaging of Tissues, Cells, and Microbial Systems. Microscopy Today. 24 (2), 24-31 (2016).
- Giesen, C., et al. Highly multiplexed imaging of tumor tissues with subcellular resolution by mass cytometry. Nature Methods. 11 (4), 417-422 (2014).
- Angelo, M., et al. Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors. Nature Medicine. 20 (4), 436-442 (2014).
- Tsujikawa, T., et al. Quantitative Multiplex Immunohistochemistry Reveals Myeloid-Inflamed Tumor-Immune Complexity Associated with Poor Prognosis. Cell Reports. 19 (1), 203-217 (2017).
- Goltsev, Y., et al. Deep Profiling of Mouse Splenic Architecture with CODEX Multiplexed Imaging. Cell. 174 (4), 968-981 (2018).
- Gerdes, M. J., et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11982-11987 (2013).
- Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 39 (6), 741-748 (1991).
- Viegas, M. S., Martins, T. C., Seco, F., do Carmo, A. An improved and cost-effective methodology for the reduction of autofluorescence in direct immunofluorescence studies on formalin-fixed paraffin-embedded tissues. European Journal of Histochemistry. 51 (1), 59-66 (2007).
- Sorensen, I. V., et al. Characterization of anti-TIMP-1 monoclonal antibodies for immunohistochemical localization in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 54 (10), 1075-1086 (2006).
- Parra, E. R., Villalobos, P., Mino, B., Rodriguez-Canales, J. Comparison of Different Antibody Clones for Immunohistochemistry Detection of Programmed Cell Death Ligand 1 (PD-L1) on Non-Small Cell Lung Carcinoma. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 26 (2), 83-93 (2018).
- Boger, C., Kalthoff, H., Goodman, S. L., Rocken, C. Validation and comparison of anti-alphavbeta3 and anti-alphavbeta5 rabbit monoclonal versus murine monoclonal antibodies in four different tumor entities. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 21 (6), 553-560 (2013).
- Torigoe, T., et al. Establishment of a monoclonal anti-pan HLA class I antibody suitable for immunostaining of formalin-fixed tissue: unusually high frequency of down-regulation in breast cancer tissues. Pathology International. 62 (5), 303-308 (2012).
- Dapson, R. W. Macromolecular changes caused by formalin fixation and antigen retrieval. Biotechnic & Histochemistry. 82 (3), 133-140 (2007).
- Sompuram, S. R., Vani, K., Hafer, L. J., Bogen, S. A. Antibodies Immunoreactive With Formalin-Fixed Tissue Antigens Recognize Linear Protein Epitopes. American Journal of Clinical Pathology. 125 (1), 82-90 (2006).
- Cassetti, M. C., et al. Antitumor efficacy of Venezuelan equine encephalitis virus replicon particles encoding mutated HPV16 E6 and E7 genes. Vaccine. 22 (3-4), 520-527 (2004).
- Kiernan, J. A. Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice, 3rd Edition. Shock. 12 (6), 479 (1999).
- Favreau, P., et al. Thin-film tunable filters for hyperspectral fluorescence microscopy. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 011017 (2014).
- van Kempen, M. J., Rijkers, G. T., Van Cauwenberge, P. B. The immune response in adenoids and tonsils. International Archives of Allergy and Immunology. 122 (1), 8-19 (2000).
- Klein, U., Dalla-Favera, R. Germinal centres: role in B-cell physiology and malignancy. Nature Reviews Immunology. 8 (1), 22-33 (2008).
- Eiben, G. L., et al. Establishment of an HLA-A*0201 Human Papillomavirus Type 16 Tumor Model to Determine the Efficacy of Vaccination Strategies in HLA-A*0201 Transgenic Mice. Cancer Research. 62, 5792-5799 (2002).
- Gonzalez, H., Hagerling, C., Werb, Z. Roles of the immune system in cancer: from tumor initiation to metastatic progression. Genes & Development. 32 (19-20), 1267-1284 (2018).
- Sica, A., Schioppa, T., Mantovani, A., Allavena, P. Tumour-associated macrophages are a distinct M2 polarised population promoting tumour progression: potential targets of anti-cancer therapy. European Jorunal of Cancer. 42 (6), 717-727 (2006).
- Au-Granier, C., et al. Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells. Journal of Visualized Experiments. (132), e56606 (2018).
- Odell, I. D., Cook, D. Immunofluorescence Techniques. Journal of Investigative Dermatology. 133 (1), 1-4 (2013).
- Xing, Y., et al. Bioconjugated quantum dots for multiplexed and quantitative immunohistochemistry. Nature Protocols. 2 (5), 1152-1165 (2007).
- Schubert, W., et al. Analyzing proteome topology and function by automated multidimensional fluorescence microscopy. Nature Biotechnology. 24 (10), 1270-1278 (2006).
- de Vries, N. L., et al. High-dimensional cytometric analysis of colorectal cancer reveals novel mediators of antitumour immunity. Gut. , 03 (2019).
- Scalia, C. R., et al. Antigen Masking During Fixation and Embedding, Dissected. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry : Official Journal of the Histochemistry Society. 65 (1), 5-20 (2017).
- Sorrelle, N., et al. Improved Multiplex Immunohistochemistry for Immune Microenvironment Evaluation of Mouse Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tissues. Journal of Immunology. 202 (1), 292-299 (2019).
- Ackerman, L. V., Ramirez, G. A. The indications for and limitations of frozen section diagnosis; a review of 1269 consecutive frozen section diagnoses. British Journal of Surgery. 46 (198), 336-350 (1959).
- Mezheyeuski, A., et al. Multispectral imaging for quantitative and compartment-specific immune infiltrates reveals distinct immune profiles that classify lung cancer patients. The Journal of Pathology. 244 (4), 421-431 (2018).
- Feng, Z., et al. Multiparametric immune profiling in HPV- oral squamous cell cancer. JCI insight. 2 (14), 93652 (2017).
- Yang, L., Liu, Z., Tan, J., Dong, H., Zhang, X. Multispectral imaging reveals hyper active TGF-β signaling in colorectal cancer. Cancer Biology & Therapy. 19 (2), 105-112 (2018).
- Blom, S., et al. Systems pathology by multiplexed immunohistochemistry and whole-slide digital image analysis. Scientific Reports. 7 (1), 15580-15580 (2017).
- Roy, S., Axelrod, H. D., Valkenburg, K. C., Amend, S., Pienta, K. J. Optimization of prostate cancer cell detection using multiplex tyramide signal amplification. Journal of Cellular Biochemistry. 120 (4), 4804-4812 (2019).
- Vickovic, S., et al. High-density spatial transcriptomics arrays for in situ tissue profiling. bioRxiv. , 563338 (2019).
