نحن نصف طريقة تلطيخ سريعة لإجراء التصوير متعدد الأطياف على الأنسجة المجمدة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
طريقة سريعة لتصوير الفلورسينس متعدد الأطياف لأقسام الأنسجة المجمدة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يتيح التصوير الفلوري المتعدد الأطياف على أنسجة البارافين المضمنة (FFPE) ذات البارافين ذات البارافين (FFPE) الكشف عن علامات متعددة في عينة نسيج واحد يمكن أن توفر معلومات حول التعبير المشترك للمستضد والتوزيع المكاني للعلامات. ومع ذلك، قد يؤدي عدم وجود أجسام مضادة مناسبة للأنسجة الثابتة الشكلية إلى تقييد طبيعة العلامات التي يمكن اكتشافها. بالإضافة إلى ذلك ، فإن طريقة تلطيخ تستغرق وقتًا طويلاً. هنا نصف طريقة سريعة لإجراء التصوير الفلوري متعدد الأطياف على الأنسجة المجمدة. وتشمل هذه الطريقة تركيبات الفلوروفور المستخدمة، والخطوات التفصيلية لتلطيخ الأنسجة المجمدة الماوس والإنسان، والمسح الضوئي، واقتناء، وإجراءات التحليل. لتحليل تلطيخ، يتم استخدام نظام التصوير متعدد الأطياف المتاحة تجاريا ً. من خلال هذه الطريقة ، تم تلطيخ ما يصل إلى ست علامات مختلفة واكتشافها في قسم واحد من الأنسجة المجمدة. يمكن لبرنامج تحليل التعلم الآلي أن يُستخدم في الخلايا الظاهرية التي يمكن استخدامها للتحليل الكمي. الطريقة الموصوفة هنا للأنسجة المجمدة مفيدة للكشف عن العلامات التي لا يمكن اكتشافها في أنسجة FFPE أو التي لا تتوفر الأجسام المضادة لأنسجة FFPE.
المقدمة
وقد أدت التطورات الأخيرة في تقنيات التصوير المجهري إلى تحسين معرفتنا وفهمنا للعمليات البيولوجية وحالات المرض بشكل كبير. في الموقع الكشف عن البروتينات في الأنسجة عن طريق الكيمياء المناعية الكروميوم (IHC) يتم بشكل روتيني في علم الأمراض. ومع ذلك ، فإن الكشف عن علامات متعددة باستخدام تلطيخ Chromogenic IHC يشكلتحديًا 1 ويتم تطوير طرق أحدث لاستخدام أساليب تلطيخ الفلور المناعي (mIF) متعددة ، حيث يتم وضع علامات بيولوجية متعددة على عينة نسيج واحد. الكشف عن علامات بيولوجية متعددة مفيد، لأن المعلومات المتعلقة بهندسة الأنسجة، والتوزيع المكاني للخلايا، والتعبير المشترك للمستضد يتم التقاطها جميعها في عينة نسيج واحد2. وقد جعل استخدام ت....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم الحصول على طحال الفأر وأنسجة ورم الماوس HLF1623 من مختبرنا. تم شراء أنسجة اللوزة البشرية من بائع تجاري. وترد التفاصيل في جدول المواد.
1. تضمين الأنسجة
- تضمين الأنسجة الطازجة في OCT (درجة حرارة القطع الأمثل) والتجميد المفاجئة باستخدام الجليد الجاف أو النيتروجين السائل.
- تخزين الأنسجة في -80 درجة مئوية.
2. التبريد
- اقطع 8 ميكرومتر في cryostat مع ضبط درجات الحرارة عند -25 درجة مئوية.
ملاحظة: يمكن تعديل سمك القسم المفضل لتوليد صور أكثر وضوحًا. - ضع المقاطع على الشرائح الزجاجية المشحونة.
- الهواء الجاف المق....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
الكشف عن علامات واحدة ملطخة على أقسام الطحال المجمدة
نظرًا لأن نظام التصوير شبه الآلي يستخدم نظام فلتر الكريستال السائل القابل للتغير (LCTF) الذي يسمح بنطاق أوسع من اكتشاف الطول الموجي25، ونظرًا لعدم تنفيذ خطوات تضخيم الإشارة هنا ، قمنا أولاً بتحسين اكتشاف أجسامنا المضادة الأولية ذات الاقتران لكل علامة على المجهر. يظهر مثال في الشكل 1، حيث كل علامة واحدة ملطخة هي حمراء ملونة زائفة. وقد تم التحقق من صحة الأجسام المضادة المترافقة اليكسا فلور المستخدم.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وقد استخدمت الأنسجة المجمدة على نطاق واسع لتصوير mIF للكشف تقليديا ثلاث إلى أربع علامات31 على الأنسجة باستخدام الطريقة المباشرة وغير المباشرة32. في الطريقة المباشرة ، يتم اقتران الأجسام المضادة بالأصباغ المفلورة أو النقاط الكمية33 لتسمية الأنسجة ، بينما في الطريقة غير المباشرة ، يتم استخدام الأجسام المضادة الأولية غير المنقبة لتسمية الأنسجة متبوعة بجسم مضاد ثانوي مفلور يترافق على وجه التحديد يتعرف على الأجسام المضادة الأولية. يمكن أيضًا استخدام بعض ط.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدى أصحاب البلاغ أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
شكر وتقدير
تم توفير التوجيه التصويري والتحليل من قبل مركز موارد البحوث - علم الأنسجة البحثي ومختبر تصوير الأنسجة الأساسية في جامعة إلينوي في شيكاغو التي أنشئت بدعم من مكتب نائب رئيس الجامعة للبحوث. تم دعم العمل من قبل المعاهد القومية للصحة / NCI RO1CA191317 إلى CLP ، من قبل المعاهد القومية للصحة / NIAMS (منحة SBDRC 1P30AR075049-01) إلى الدكتور A. Paller ، وبدعم من مركز روبرت H. Lurie الشامل للسرطان إلى مركز تقييم المناعة في جامعة نورث وسترن.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| الأسيتون (الدرجة النسيجية) | فيشر سيانتيفيك | A16F-1GAL | الأنسجة المثبتة Alexa |
| Fluor 488 المضادة للفأر CD3 | BioLegend | 100212 | Clone - 17A2 ؛ الجسم المضاد المترافق الأولي |
| Alexa Fluor 488 ، eBioscience المضاد للإنسان CD20 | ThermoFisher Scientific | 53-0202-82 | Clone - L26 ؛ الجسم المضاد المترافق الأولي |
| Alexa Fluor 555 Mouse anti-Ki-67 | BD Biosciences | 558617 | الجسم المضاد المترافق الأولي |
| Alexa Fluor 594 المضاد للإنسان CD3 | BioLegend | 300446 | Clone - UCHT1 ؛ الجسم المضاد المترافق الأولي |
| Alexa Fluor 594 المضاد للفأر CD8a | BioLegend | 100758 | Clone - 53-6.7 ؛ الجسم المضاد المترافق الأولي |
| Alexa Fluor 647 المضاد للإنسان CD8a | BioLegend | 372906 | Clone - C8 / 144B ؛ الجسم |
| المضاد المترافق الأوليAlexa Fluor 647 مضاد للفأر CD206 (MMR) BioLegend | 141711 | Clone - C068C2 ؛ الجسم المضاد المترافق | |
| الأولي Alexa Fluor 647 المضاد للفأر CD4 الأجسام المضادة | BioLegend | 100426 | Clone - GK1.5 ؛ الجسم المضاد المترافق الأولي |
| C57BL / 6 Mouse | Charles River Laboratories | 27 | الأنسجة المجمدة للفأر المستخدمة للتدريب متعدد الأطياف |
| Coplin Jar | Sigma Aldrich | S6016-6EA | شرائح الترطيب والغسيل DAPI |
| Solution | BD Biosciences | 564907 | صبغة الحمض النووي |
| شرائح مشحونة بالزجاج الأبيض الماس DOT | Scientific | DW7590W | أقسام الأنسجة الملتصقة |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x (بدون Ca و Mg) | Fisher Scientific | MT21031CV | الغسيل وغطاء |
| ختم الذهب المخفف زلات | ThermoFisher Scientific | 3306 | حماية الأنسجة الملطخة كتلة |
| الأنسجة المجمدة للوزتين البشرية OCT كتلة الأنسجة المجمدة | AMSbio | AMS6023 | الأنسجة المجمدة البشرية المستخدمة في تلطيخ مصل بشري متعدد الأطياف |
| 1x | Gemini Bio-Products | 100-512 | حجب ومخفف للأنسجة البشرية |
| فيForm | Akoya Biosciences | الإصدار 2.4.1 | برنامج التعلم الآلي |
| PerCP / Cyanine5.5 مضاد للإنسان CD4 | BioLegend | 300529 | Clone - RPA-T4 ؛ الجسم المضاد المترافق الأولي |
| PerCP-Cy 5.5 Rat Anti-CD11b | BD Biosciences | 550993 | Clone - M1 / 70 ؛ الجسم المضاد المترافق الأولي |
| Phenochart | Akoya Biosciences | الإصدار 1.0.8 | برنامج مسح الشرائح بالكامل |
| ProLong Diamond Antifade | Mountant ThermoFisher Scientific | P36965 | Mounting medium |
| Research Cryostat | Leica Biosystems | CM3050 S | قسم الأنسجة |
| Superblock 1x | ThermoFisher Scientific | 37515 | حجب أنسجة الفئران |
| Tissue-Tek O.C.T Solution | Sakura Finetek | 4583 | الأنسجة |
| Vectra 3.0 نظام التصوير الكمي الآلي لعلم الأمراض ، 6 شرائح | Akoya Biosciences | CLS142568 | التصوير شبه الآلي متعدد الأطياف نظام |
| Vectra Software | Akoya Biosciences | الإصدار 3.0.5 | برنامج لتشغيل المجهر |
المراجع
- van der Loos, C. M. Chromogens in Multiple Immunohistochemical Staining Used for Visual Assessment and Spectral Imaging: The Colorful Future. Journal of Histotechnology. 33 (1), 31-40 (2010).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
