Un método rápido para imágenes de fluorescencia multiespectral de secciones de tejido congelado

Summary

Describimos un método de tinción rápida para realizar imágenes multiespectrales en tejidos congelados.

Abstract

Las imágenes de fluorescencia multiespectral en tejidos de parafina incrustada en formalina (FFPE) permiten la detección de múltiples marcadores en una sola muestra de tejido que pueden proporcionar información sobre la coexpresión de antígenos y la distribución espacial de los marcadores. Sin embargo, la falta de anticuerpos adecuados para los tejidos fijados con formalina puede restringir la naturaleza de los marcadores que se pueden detectar. Además, el método de tinción consume mucho tiempo. Aquí describimos un método rápido para realizar imágenes de fluorescencia multiespectral en tejidos congelados. El método incluye las combinaciones de fluoróforos utilizadas, pasos detallados para la tinción de tejidos congelados de ratón y humanos, y los procedimientos de escaneo, adquisición y análisis. Para el análisis de tinción, se utiliza un sistema de imágenes de fluorescencia multiespectral semiautomática disponible en el comercio. A través de este método, se teñen y detectaron hasta seis marcadores diferentes en una sola sección de tejido congelado. El software de análisis de aprendizaje automático puede fenotipo células que se pueden utilizar para el análisis cuantitativo. El método descrito aquí para los tejidos congelados es útil para la detección de marcadores que no se pueden detectar en tejidos FFPE o para los que los anticuerpos no están disponibles para los tejidos FFPE.

Introduction

Los avances recientes en las técnicas de imágenes microscópicas han mejorado significativamente nuestro conocimiento y comprensión de los procesos biológicos y los estados de las enfermedades. La detección in situ de proteínas en los tejidos a través de la inmunohistoquímica cromogénica (IHC) se realiza rutinariamente en patología. Sin embargo, la detección de múltiples marcadores mediante la tinción cromogénica de IHC es un desafío¹ y se están desarrollando métodos más recientes para utilizar enfoques de tinción de inmunofluorescencia múltiple (mIF), en los que se están desarrollando múltiples marcadores biológicos etiquetados en una sola muestra de tejido. La detección de múltiples marcadores biológicos es útil, ya que la información relacionada con la arquitectura tisular, la distribución espacial de las células y la coexpresión de antígenos se capturan en una sola muestra de tejido^2. El uso de la tecnología de imágenes multiespectrales de fluorescencia ha hecho posible la detección de múltiples marcadores biológicos. En esta tecnología, utilizando ópticas específicas, los espectros de fluorescencia de cada fluoróforo individual pueden separarse o “sin mezclar”, permitiendo la detección de múltiples marcadores sin ninguna conversación cruzada espectral^3. La fluorescencia multiespectral se está convirtiendo en un enfoque crítico en biología celular, desarrollo de fármacos preclínicos, patología clínica y perfilinmune tumoral^4,,5,6. Es importante destacar que la distribución espacial de las células inmunitarias (específicamente células T CD8) puede servir como factor pronóstico para los pacientes con tumores existentes⁷.

Se han desarrollado varios enfoques para la tinción de fluorescencia multiplex y se pueden realizar simultáneamente o secuencialmente. En el método de tinción simultánea, todos los anticuerpos se suman como un cóctel en un solo paso para etiquetar el tejido. La tecnología UltraPlex utiliza un cóctel de anticuerpos primarios conjugados con ya hapten seguido de un cóctel de anticuerpos secundarios anti-hapten conjugados con fluoróforos. La tecnología InSituPlex⁸ utiliza un cóctel de anticuerpos primarios únicos conjugados por EL ADN que se añaden simultáneamente al tejido seguido de un paso de amplificación y finalmente sondas conjugadas con fluoróforoque que son complementarias a cada secuencia de ADN única en el anticuerpo primario. Ambas tecnologías permiten la detección de cuatro marcadores más 4′,6-diamino-2-phenylindole (DAPI) para la tinción nuclear. Otros dos enfoques para la tinción multiplexación simultánea se basan en espectrometría de masas iónquinas^{secundarias 9.} El sistema de imágenes Hyperion utiliza citometría de masa de imágenes¹⁰ para detectar hasta 37 marcadores. Esta tecnología utiliza un cóctel de anticuerpos conjugados metálicos para manchar los tejidos, y áreas específicas de los tejidos son abladas por un láser y transferidas a un citómetro de masa donde se detectan los iones metálicos. Otra tecnología similar es la IONPath, que utiliza la tecnología de imágenes de haz iónico multiplexado¹¹. Esta tecnología utiliza un instrumento de espectrometría de masas modificado y una fuente de iones de oxígeno en lugar de láser para ablar los anticuerpos conjugados de metal. Si bien todos estos enfoques simultáneos de tinción múltiple permiten la detección de múltiples marcadores, no se pueden subestimar los costos involucrados por la conjugación de ADN, hapens o metales a anticuerpos, la pérdida de tejido debido a la ablación y el procesamiento de imágenes extenso para la desmezcla. Además, los kits y los protocolos de tinción están actualmente disponibles sólo para los tejidos FFPE y el desarrollo de paneles personalizados implica tiempo y gastos adicionales.

El método de tinción múltiple secuencial, en cambio, incluye etiquetar el tejido con un anticuerpo en un marcador, desmontar para eliminar el anticuerpo, seguido de repeticiones secuenciales de este proceso para etiquetar múltiples marcadores^12. La amplificación de señal de tiramida (TSA) es el método de multiplexación secuencial más utilizado. Otras dos tecnologías de multiplexación utilizan una combinación de métodos de tinción simultáneos y secuenciales. La plataforma^{CODEX 13} emplea un cóctel de anticuerpos conjugados con secuencias únicas de oligonucleótidos de ADN que finalmente se etiquetan con un fluoróforo utilizando un paso de polimerización indexado seguido de imágenes, desmontaje y repetición del proceso para detectar hasta 50 marcadores. El enfoque de tinción múltiple MultiOmyx¹⁴ es una iteración de tinción con un cóctel de tres a cuatro anticuerpos conjugados con fluoróforos, imágenes, temple los fluoróforos y repetición de este ciclo para detectar hasta 60 marcadores en una sola sección. Al igual que el método de tinción múltiple simultánea, mientras que se puede detectar una amplia gama de marcadores, el tiempo involucrado en la tinción, la adquisición de imágenes, el procesamiento y el análisis es extenso. El paso de desmontaje/enfriamiento implica calentar y/o blanquear la muestra de tejido y, por lo tanto, el enfoque secuencial de tinción multiplex a los tejidos FFPE que mantienen la integridad del tejido al calentarse o blanquear.

La fijación de formalina y la posterior incrustación de parafina se realiza fácilmente en un entorno clínico, los bloques de tejido son fáciles de almacenar y varios protocolos de tinción multiplex están disponibles. Sin embargo, el procesamiento, incrustación y desparafinación de los tejidos FFPE, así como la recuperación de antígeno¹⁵, un proceso por el cual los anticuerpos pueden acceder mejor a los epítopos, es lento. Además, el procesamiento implicado en los tejidos FFPE contribuye a la autofluorescencia¹⁶ y enmascara los epítopos diana, lo que resulta en la variabilidad y falta de clon de anticuerpos disponible para detectar antígenos en los tejidos FFPE^17,,18,,19. Un ejemplo es el antígeno leucocito humano (HLA) clase I alelos²⁰. Por el contrario, la congelación rápida de los tejidos no implica extensos pasos de procesamiento antes o después de la fijación, eludiendo la necesidad de recuperación de antígenos^21,22, y lo que es beneficioso para detectar una gama más amplia de objetivos. Por lo tanto, el uso de tejidos congelados para la fluorescencia multiespectral puede ser valioso para detectar dianas para estudios preclínicos y clínicos.

Dadas las limitaciones mencionadas anteriormente al usar tejidos FFPE, preguntamos si se pueden realizar imágenes de fluorescencia multiespectral en tejidos congelados. Para abordar esta pregunta, probamos un método de tinción múltiple simultánea utilizando un panel de anticuerpos conjugados con fluoróforos para detectar múltiples antígenos y analizamos la tinción utilizando un sistema de imágenes multiespectrales semiautomáticos. Pudimos manchar simultáneamente hasta seis marcadores en una sola sección de tejido en un solo radio de 90 minutos.

Protocol

El bazo de ratón y los tejidos tumorales de ratón HLF1623 se obtuvieron de nuestro laboratorio. El tejido de las amígdalas humanas fue comprado a un vendedor comercial. Los detalles se proporcionan en la Tabla de Materiales. 1. Incorporación de tejidos Incruste tejido fresco en la solución OCT (temperatura de corte óptima) y congele a presión utilizando hielo seco o nitrógeno líquido. Conservar los tejidos a -80oC. </ol…

Representative Results

Detección de marcadores de un solo mancha en secciones de bazo congeladoComo el sistema de imágenes semiautomatizadautiliza un sistema de filtro ajustable de cristal líquido (LCTF) que permite una gama más amplia de detección de longitud de onda25,y debido a que no se realizaron pasos de amplificación de señal aquí, primero optimizamos la detección de nuestros anticuerpos conjugados primarios para cada marcador en el microscopio. Un ejemplo se muestra en <strong class…

Discussion

Los tejidos congelados se han utilizado ampliamente para la toma de imágenes mIF para detectar tradicionalmente de tres a cuatro marcadores³¹ en un tejido utilizando el método directo e indirecto^32. En el método directo, los anticuerpos se conjugan con los tintes fluoresciosos o los puntos cuánticos³³ para etiquetar el tejido, mientras que en el método indirecto, se utiliza un anticuerpo primario no conjugado para etiquetar el tejido seguido de …

Materials

Acetone (histological grade)	Fisher Scientific	A16F-1GAL	Fixing tissues
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3	BioLegend	100212	Clone – 17A2; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 488, eBioscience anti-human CD20	ThermoFisher Scientific	53-0202-82	Clone – L26; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 555 Mouse anti-Ki-67	BD Biosciences	558617	Primary conjugated antibody
Alexa Fluor 594 anti-human CD3	BioLegend	300446	Clone – UCHT1; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 594 anti-mouse CD8a	BioLegend	100758	Clone – 53-6.7; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 647 anti-human CD8a	BioLegend	372906	Clone – C8/144B; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD206 (MMR)	BioLegend	141711	Clone – C068C2; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD4 Antibody	BioLegend	100426	Clone – GK1.5; primary conjugated antibody
C57BL/6 Mouse	Charles River Laboratories	27	Mouse frozen tissues used for multispectral training
Coplin Jar	Sigma Aldrich	S6016-6EA	Rehydrating and washing slides
DAPI Solution	BD Biosciences	564907	Nucleic Acid stain
Diamond White Glass Charged Slides	DOT Scientific	DW7590W	Adhering tissue sections
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x (without Ca and Mg)	Fisher Scientific	MT21031CV	Washing and diluent
Gold Seal Cover Slips	ThermoFisher Scientific	3306	Protecting stained tissues
Human Normal Tonsil OCT frozen tissue block	AMSBio	AMS6023	Human frozen tissue used for multispectral staining
Human Serum 1X	Gemini Bio-Products	100-512	Blocking and diluent for human tissues
inForm	Akoya Biosciences	Version 2.4.1	Machine learning software
PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD4	BioLegend	300529	Clone – RPA-T4; primary conjugated antibody
PerCP-Cy 5.5 Rat Anti-CD11b	BD Biosciences	550993	Clone – M1/70; primary conjugated antibody
Phenochart	Akoya Biosciences	Version 1.0.8	Whole slide scan software
ProLong Diamond Antifade Mountant	ThermoFisher Scientific	P36965	Mounting medium
Research Cryostat	Leica Biosystems	CM3050 S	Sectioning tissues
Superblock 1X	ThermoFisher Scientific	37515	Blocking mouse tissues
Tissue-Tek O.C.T Solution	Sakura Finetek	4583	Embedding tissues
Vectra 3.0 Automated Quantitative Pathology Imaging System, 6 Slide	Akoya Biosciences	CLS142568	Semi-automated multispectral imaging system
Vectra Software	Akoya Biosciences	Version 3.0.5	Software to operate microscope