JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Een snelle methode voor multispectrale fluorescentiebeeldvorming van bevroren weefselsecties

Published: March 30, 2020
doi:
10.3791/60806
, , ,
1Robert Lurie Comprehensive Cancer Center and Department of Dermatology, Feinberg School of Medicine,Northwestern University, 2Department of Pathology,University of Illinois at Chicago, 3Department of Microbiology and Immunology, Feinberg School of Medicine,Northwestern University

Summary

We beschrijven een snelle kleuringsmethode om multispectrale beeldvorming op bevroren weefsels uit te voeren.

Abstract

Multispectrale fluorescentiebeeldvorming op formaline-vaste paraffine-embedded (FFPE) weefsels maakt het mogelijk om meerdere markers in één weefselmonster te detecteren die informatie kunnen geven over antigeencoexpressie en ruimtelijke verdeling van de markers. Een gebrek aan geschikte antilichamen voor formaline-vaste weefsels kan echter de aard van de gedetecteerde merkers beperken. Bovendien is de kleurmethode tijdrovend. Hier beschrijven we een snelle methode om multispectrale fluorescentiebeeldvorming uit te voeren op bevroren weefsels. De methode omvat de gebruikte fluorophorecombinaties, gedetailleerde stappen voor het kleuren van muizen- en menselijke bevroren weefsels en de scan-, acquisitie- en analyseprocedures. Voor kleuringsanalyse wordt gebruik gemaakt van een commercieel verkrijgbaar semi-geautomatiseerd multispectral eibeeldbeeldvormingssysteem. Door deze methode werden tot zes verschillende markers gekleurd en gedetecteerd in een enkele bevroren weefsel sectie. De machine learning analyse software kan fenotype cellen die kunnen worden gebruikt voor kwantitatieve analyse. De hier beschreven methode voor bevroren weefsels is nuttig voor de detectie van markers die niet kunnen worden gedetecteerd in FFPE-weefsels of waarvoor antilichamen niet beschikbaar zijn voor FFPE-weefsels.

Introduction

Recente ontwikkelingen in microscopische beeldvormingstechnieken hebben onze kennis en begrip van biologische processen en ziektetoestanden aanzienlijk verbeterd. In situ detectie van eiwitten in weefsels via chromogene immunohistochemie (IHC) wordt routinematig uitgevoerd in pathologie. Echter, detectie van meerdere markers met behulp van chromogene IHC kleuring is uitdagend1 en nieuwere methoden om multiplex immunofluorescentie (mIF) kleuring benaderingen te gebruiken, waarbij meerdere biologische markers worden gelabeld op een enkel weefsel monster, worden ontwikkeld. De detectie van meerdere biologische markers is nuttig, omdat informatie met betrekking tot weefselarchitectuur, ruimtelijke verdeling van cellen en antigeenco-expressie allemaal worden vastgelegd in één weefselmonster2. Het gebruik van multispectrale fluorescentiebeeldvormingstechnologie heeft detectie van meerdere biologische markers mogelijk gemaakt. In deze technologie kan met behulp van specifieke optiek de fluorescentiespectra van elke afzonderlijke fluorophore worden gescheiden of “ongemengd”, waardoor meerdere markers kunnen worden gedetecteerd zonder spectrale kruisspraak3. Multispectrale fluorescentiebeeldvorming wordt een kritische benadering in de celbiologie, preklinische medicijnontwikkeling, klinische pathologie en tumorimmuunprofilering4,5,6. Belangrijk is dat de ruimtelijke verdeling van immuuncellen (met name CD8 T-cellen) kan dienen als een prognostische factor voor patiënten met bestaande tumoren7.

Verschillende benaderingen van multiplex fluorescentie kleuring zijn ontwikkeld en kan gelijktijdig of sequentieel worden uitgevoerd. In de simultaan kleuringmethode worden alle antilichamen als cocktail in één stap bij elkaar opgeteld om het weefsel te labelen. UltraPlex-technologie maakt gebruik van een cocktail van hapten-geconjugeerde primaire antilichamen, gevolgd door een cocktail van fluorophore-geconjugeerde anti-hapten secundaire antilichamen. InSituPlex technologie8 maakt gebruik van een cocktail van unieke DNA-geconjugeerde primaire antilichamen die tegelijkertijd worden toegevoegd aan het weefsel, gevolgd door een versterking stap en ten slotte fluorophore-geconjugeerde sondes die complementair zijn aan elke unieke DNA-sequentie op het primaire antilichaam. Beide technologieën maken de detectie van vier markers plus 4′,6-diamino-2-phenylindole (DAPI) voor nucleaire kleuring mogelijk. Twee andere benaderingen voor gelijktijdige multiplex kleuring zijn gebaseerd op secundaire ionenmassaspectrometrie9. Het Hyperion Imaging System maakt gebruik van beeldmassacytometrie10 om tot 37 markers te detecteren. Deze technologie maakt gebruik van een cocktail van met metaal geconjugeerde antilichamen om de weefsels te bevlekken, en specifieke gebieden van de weefsels worden door een laser ontdaan en overgebracht naar een massacytometer waar de metaalionen worden gedetecteerd. Een andere soortgelijke technologie is de IONPath, die multiplexed ionbeam imaging technologiegebruikt 11. Deze technologie maakt gebruik van een gemodificeerde massaspectrometrie instrument en een zuurstof ionen bron in plaats van laser om de metaal-geconjugeerde antilichamen ablate. Hoewel al deze gelijktijdige multiplex vlekken benaderingen de detectie van meerdere markers mogelijk te maken, de kosten die betrokken zijn voor het conjugeren van DNA, haptens, of metalen aan antilichamen, het verlies van weefsel als gevolg van ablatie, en de uitgebreide beeldverwerking voor het niet mengen van de mengmenging kan niet worden onderschat. Bovendien zijn kits en kleuringprotocollen momenteel alleen beschikbaar voor FFPE-weefsels en brengt het ontwikkelen van aangepaste panelen extra tijd en uitgaven met zich mee.

De sequentiële multiplex kleuring methode, in tegenstelling, omvat het etiketteren van het weefsel met een antilichaam aan een marker, strippen om het antilichaam te verwijderen, gevolgd door opeenvolgende herhalingen van dit proces om meerdere markers label12. De tyramide signaalversterking (TSA) is de meest gebruikte sequentiële multiplexing methode. Twee andere multiplexing technologieën maken gebruik van een combinatie van gelijktijdige en sequentiële kleuring methoden. De CODEX platform13 maakt gebruik van een cocktail van antilichamen geconjugeerd om unieke DNA oligonucleotide sequenties die uiteindelijk worden gelabeld met een fluorophore met behulp van een geïndexeerde polymerisatie stap gevolgd door beeldvorming, strippen, en het herhalen van het proces om te detecteren tot 50 markers. De MultiOmyx multiplex kleuring aanpak14 is een iteratie van vlekken met een cocktail van drie tot vier gefluorofe-geconjugeerde antilichamen, beeldvorming, het doven van de fluorophoren, en het herhalen van deze cyclus te detecteren tot 60 markers op een enkele sectie. Vergelijkbaar met de gelijktijdige multiplex kleuring methode, terwijl een breed scala van markers kan worden gedetecteerd, de tijd die betrokken zijn bij kleuring, beeldverwerving, verwerking, en analyse is uitgebreid. De strippen / blussen stap omvat verwarming en / of bleken van het weefsel monster en dus, de sequentiële multiplex kleuring aanpak wordt vaak uitgevoerd op FFPE weefsels die weefsel integriteit te handhaven bij het verwarmen of bleken.

Formaline fixatie en daaropvolgende paraffine inbedding wordt gemakkelijk uitgevoerd in een klinische omgeving, weefselblokken zijn gemakkelijk op te slaan en verschillende multiplex kleuringprotocollen zijn beschikbaar. Echter, de verwerking, inbedding, en deparaffinisatie van FFPE weefsels, evenals antigeen ophalen15, een proces waarbij antilichamen beter toegang epitopes, is tijdrovend. Bovendien draagt de verwerking van FFPE-weefsels bij tot autofluorescentie16 en maskers op epitopen, wat resulteert in de variabiliteit en het gebrek aan antilichaamkloon die beschikbaar is om antigenen in FFPE-weefsels op te sporen17,18,19. Een voorbeeld is de menselijke leukocyteantigeen (HLA) klasse I alleles20. In tegenstelling, snap bevriezing van weefsels omvat geen uitgebreide verwerking stappen voorafgaand aan of na de vaststelling, het omzeilen van de noodzaak voor antigeen terugwinning21,22, en waardoor het gunstig is voor het opsporen van een breder scala van doelen. Daarom kan het gebruik van bevroren weefsels voor multispectrale fluorescentiebeeldvorming waardevol zijn om doelen voor preklinische en klinische studies te detecteren.

Gezien de bovengenoemde beperkingen bij het gebruik van FFPE weefsels, vroegen we of multispectrale fluorescentie beeldvorming kan worden uitgevoerd op bevroren weefsels. Om deze vraag aan te pakken, hebben we een gelijktijdige multiplex kleurmethode getest met behulp van een paneel van gefluorofe-geconjugeerde antilichamen om meerdere antigenen te detecteren en analyseerden we de kleuring met behulp van een semi-geautomatiseerd multispectral imaging systeem. We waren in staat om tegelijkertijd vlek tot zes markers in een enkel weefsel sectie binnen 90 min.

Protocol

Muismilt en HLF16 muistumorweefsels23 werden verkregen uit ons laboratorium. Menselijk tonsillenweefsel werd gekocht bij een commerciële leverancier. Details zijn opgenomen in de tabel van materialen. 1. Weefselinbedding Sluit vers weefsel in octop (optimale snijtemperatuur) oplossing en snap bevriezen met behulp van droogijs of vloeibare stikstof. Bewaar weefsels op -80 °C. 2. Cryosectioning <ol…

Representative Results

Detectie van enkelbevlekte markeringen op bevroren miltsectiesAangezien het semi-geautomatiseerde beeldvormingssysteem gebruik maakt van een vloeistofkristaltable filter (LCTF) systeem dat een breder bereik van golflengtedetectie25mogelijk maakt , en omdat hier geen signaalversterkingsstappen zijn uitgevoerd, hebben we eerst de detectie geoptimaliseerd van onze primaire geconjugeerde antilichamen voor elke marker op de microscoop. Een voorbeeld wordt weergegeven in <strong cla…

Discussion

Bevroren weefsels zijn op grote schaal gebruikt voor mIF-beeldvorming om traditioneel drie tot vier markers31 op een weefsel te detecteren met behulp van de directe en indirecte methode32. In de directe methode worden antilichamen geconjugeerd tot fluorescerende kleurstoffen of quantumdots33 om het weefsel te labelen, terwijl in de indirecte methode een niet-geconjugeerd primair antilichaam wordt gebruikt om het weefsel te labelen, gevolgd door een d…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Imaging en analyse begeleiding werd verstrekt door het Research Resources Center – Research Histology and Tissue Imaging Core aan de Universiteit van Illinois in Chicago opgericht met de steun van het kantoor van de vice-kanselier voor onderzoek. Het werk werd ondersteund door NIH/NCI RO1CA191317 aan CLP, door NIH/NIAMS (SBDRC grant 1P30AR075049-01) aan Dr. A. Paller, en door ondersteuning van het Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center aan de Immunotherapy Assessment Core aan de Northwestern University.

Materials

Acetone (histological grade) Fisher Scientific A16F-1GAL Fixing tissues
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 BioLegend 100212 Clone – 17A2; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 488, eBioscience anti-human CD20 ThermoFisher Scientific 53-0202-82 Clone – L26; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 555 Mouse anti-Ki-67 BD Biosciences 558617 Primary conjugated antibody
Alexa Fluor 594 anti-human CD3 BioLegend 300446 Clone – UCHT1; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 594 anti-mouse CD8a BioLegend 100758 Clone – 53-6.7; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 647 anti-human CD8a BioLegend 372906 Clone – C8/144B; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD206 (MMR) BioLegend 141711 Clone – C068C2; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD4 Antibody BioLegend 100426 Clone – GK1.5; primary conjugated antibody
C57BL/6 Mouse Charles River Laboratories 27 Mouse frozen tissues used for multispectral training
Coplin Jar Sigma Aldrich S6016-6EA Rehydrating and washing slides
DAPI Solution BD Biosciences 564907 Nucleic Acid stain
Diamond White Glass Charged Slides DOT Scientific DW7590W Adhering tissue sections
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x (without Ca and Mg) Fisher Scientific MT21031CV Washing and diluent
Gold Seal Cover Slips ThermoFisher Scientific 3306 Protecting stained tissues
Human Normal Tonsil OCT frozen tissue block AMSBio AMS6023 Human frozen tissue used for multispectral staining
Human Serum 1X Gemini Bio-Products 100-512 Blocking and diluent for human tissues
inForm Akoya Biosciences Version 2.4.1 Machine learning software
PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD4 BioLegend 300529 Clone – RPA-T4; primary conjugated antibody
PerCP-Cy 5.5 Rat Anti-CD11b BD Biosciences 550993 Clone – M1/70; primary conjugated antibody
Phenochart Akoya Biosciences Version 1.0.8 Whole slide scan software
ProLong Diamond Antifade Mountant ThermoFisher Scientific P36965 Mounting medium
Research Cryostat Leica Biosystems CM3050 S Sectioning tissues
Superblock 1X ThermoFisher Scientific 37515 Blocking mouse tissues
Tissue-Tek O.C.T Solution Sakura Finetek 4583 Embedding tissues
Vectra 3.0 Automated Quantitative Pathology Imaging System, 6 Slide Akoya Biosciences CLS142568 Semi-automated multispectral imaging system
Vectra Software Akoya Biosciences Version 3.0.5 Software to operate microscope
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. van der Loos, C. M. Chromogens in Multiple Immunohistochemical Staining Used for Visual Assessment and Spectral Imaging: The Colorful Future. Journal of Histotechnology. 33 (1), 31-40 (2010).
  2. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  3. Bian, L., et al. Multispectral imaging using a single bucket detector. Scientific Reports. 6, 24752 (2016).
  4. Zhou, L., El-Deiry, W. S. Multispectral fluorescence imaging. Journal of Nuclear Medicine. 50 (10), 1563-1566 (2009).
  5. Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
  6. Wickenhauser, C., Pico de Coaña, Y., et al. . Immune Checkpoint Blockade: Methods and Protocols. , 13-31 (2019).
  7. Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 3 (1), 47 (2015).
  8. Manesse, M., Patel, K. K., Bobrow, M., Downing, S. R. The InSituPlex((R)) Staining Method for Multiplexed Immunofluorescence Cell Phenotyping and Spatial Profiling of Tumor FFPE Samples. Methods in Molecular Biology. 2055, 585-592 (2020).
  9. Gamble, L. J., Anderton, C. R. Secondary Ion Mass Spectrometry Imaging of Tissues, Cells, and Microbial Systems. Microscopy Today. 24 (2), 24-31 (2016).
  10. Giesen, C., et al. Highly multiplexed imaging of tumor tissues with subcellular resolution by mass cytometry. Nature Methods. 11 (4), 417-422 (2014).
  11. Angelo, M., et al. Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors. Nature Medicine. 20 (4), 436-442 (2014).
  12. Tsujikawa, T., et al. Quantitative Multiplex Immunohistochemistry Reveals Myeloid-Inflamed Tumor-Immune Complexity Associated with Poor Prognosis. Cell Reports. 19 (1), 203-217 (2017).
  13. Goltsev, Y., et al. Deep Profiling of Mouse Splenic Architecture with CODEX Multiplexed Imaging. Cell. 174 (4), 968-981 (2018).
  14. Gerdes, M. J., et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11982-11987 (2013).
  15. Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 39 (6), 741-748 (1991).
  16. Viegas, M. S., Martins, T. C., Seco, F., do Carmo, A. An improved and cost-effective methodology for the reduction of autofluorescence in direct immunofluorescence studies on formalin-fixed paraffin-embedded tissues. European Journal of Histochemistry. 51 (1), 59-66 (2007).
  17. Sorensen, I. V., et al. Characterization of anti-TIMP-1 monoclonal antibodies for immunohistochemical localization in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 54 (10), 1075-1086 (2006).
  18. Parra, E. R., Villalobos, P., Mino, B., Rodriguez-Canales, J. Comparison of Different Antibody Clones for Immunohistochemistry Detection of Programmed Cell Death Ligand 1 (PD-L1) on Non-Small Cell Lung Carcinoma. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 26 (2), 83-93 (2018).
  19. Boger, C., Kalthoff, H., Goodman, S. L., Rocken, C. Validation and comparison of anti-alphavbeta3 and anti-alphavbeta5 rabbit monoclonal versus murine monoclonal antibodies in four different tumor entities. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 21 (6), 553-560 (2013).
  20. Torigoe, T., et al. Establishment of a monoclonal anti-pan HLA class I antibody suitable for immunostaining of formalin-fixed tissue: unusually high frequency of down-regulation in breast cancer tissues. Pathology International. 62 (5), 303-308 (2012).
  21. Dapson, R. W. Macromolecular changes caused by formalin fixation and antigen retrieval. Biotechnic & Histochemistry. 82 (3), 133-140 (2007).
  22. Sompuram, S. R., Vani, K., Hafer, L. J., Bogen, S. A. Antibodies Immunoreactive With Formalin-Fixed Tissue Antigens Recognize Linear Protein Epitopes. American Journal of Clinical Pathology. 125 (1), 82-90 (2006).
  23. Cassetti, M. C., et al. Antitumor efficacy of Venezuelan equine encephalitis virus replicon particles encoding mutated HPV16 E6 and E7 genes. Vaccine. 22 (3-4), 520-527 (2004).
  24. Kiernan, J. A. Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice, 3rd Edition. Shock. 12 (6), 479 (1999).
  25. Favreau, P., et al. Thin-film tunable filters for hyperspectral fluorescence microscopy. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 011017 (2014).
  26. van Kempen, M. J., Rijkers, G. T., Van Cauwenberge, P. B. The immune response in adenoids and tonsils. International Archives of Allergy and Immunology. 122 (1), 8-19 (2000).
  27. Klein, U., Dalla-Favera, R. Germinal centres: role in B-cell physiology and malignancy. Nature Reviews Immunology. 8 (1), 22-33 (2008).
  28. Eiben, G. L., et al. Establishment of an HLA-A*0201 Human Papillomavirus Type 16 Tumor Model to Determine the Efficacy of Vaccination Strategies in HLA-A*0201 Transgenic Mice. Cancer Research. 62, 5792-5799 (2002).
  29. Gonzalez, H., Hagerling, C., Werb, Z. Roles of the immune system in cancer: from tumor initiation to metastatic progression. Genes & Development. 32 (19-20), 1267-1284 (2018).
  30. Sica, A., Schioppa, T., Mantovani, A., Allavena, P. Tumour-associated macrophages are a distinct M2 polarised population promoting tumour progression: potential targets of anti-cancer therapy. European Jorunal of Cancer. 42 (6), 717-727 (2006).
  31. Au-Granier, C., et al. Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells. Journal of Visualized Experiments. (132), e56606 (2018).
  32. Odell, I. D., Cook, D. Immunofluorescence Techniques. Journal of Investigative Dermatology. 133 (1), 1-4 (2013).
  33. Xing, Y., et al. Bioconjugated quantum dots for multiplexed and quantitative immunohistochemistry. Nature Protocols. 2 (5), 1152-1165 (2007).
  34. Schubert, W., et al. Analyzing proteome topology and function by automated multidimensional fluorescence microscopy. Nature Biotechnology. 24 (10), 1270-1278 (2006).
  35. de Vries, N. L., et al. High-dimensional cytometric analysis of colorectal cancer reveals novel mediators of antitumour immunity. Gut. , 03 (2019).
  36. Scalia, C. R., et al. Antigen Masking During Fixation and Embedding, Dissected. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry : Official Journal of the Histochemistry Society. 65 (1), 5-20 (2017).
  37. Sorrelle, N., et al. Improved Multiplex Immunohistochemistry for Immune Microenvironment Evaluation of Mouse Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tissues. Journal of Immunology. 202 (1), 292-299 (2019).
  38. Ackerman, L. V., Ramirez, G. A. The indications for and limitations of frozen section diagnosis; a review of 1269 consecutive frozen section diagnoses. British Journal of Surgery. 46 (198), 336-350 (1959).
  39. Mezheyeuski, A., et al. Multispectral imaging for quantitative and compartment-specific immune infiltrates reveals distinct immune profiles that classify lung cancer patients. The Journal of Pathology. 244 (4), 421-431 (2018).
  40. Feng, Z., et al. Multiparametric immune profiling in HPV- oral squamous cell cancer. JCI insight. 2 (14), 93652 (2017).
  41. Yang, L., Liu, Z., Tan, J., Dong, H., Zhang, X. Multispectral imaging reveals hyper active TGF-β signaling in colorectal cancer. Cancer Biology & Therapy. 19 (2), 105-112 (2018).
  42. Blom, S., et al. Systems pathology by multiplexed immunohistochemistry and whole-slide digital image analysis. Scientific Reports. 7 (1), 15580-15580 (2017).
  43. Roy, S., Axelrod, H. D., Valkenburg, K. C., Amend, S., Pienta, K. J. Optimization of prostate cancer cell detection using multiplex tyramide signal amplification. Journal of Cellular Biochemistry. 120 (4), 4804-4812 (2019).
  44. Vickovic, S., et al. High-density spatial transcriptomics arrays for in situ tissue profiling. bioRxiv. , 563338 (2019).

Tags

Multispectral Fluorescence ImagingBiomarker DetectionCo-localizationRapid Staining MethodSpectral LibraryMachine LearningImage Analysis
check_url/60806?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Jaishankar, D., Cosgrove, C., Deaton, R. J., Le Poole, I. C. A Rapid Method for Multispectral Fluorescence Imaging of Frozen Tissue Sections. J. Vis. Exp. (157), e60806, doi:10.3791/60806 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image