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Immunology and Infection

냉동 조직 섹션의 다스펙트럼 형광 이미징을위한 신속한 방법

Published: March 30, 2020
doi:
10.3791/60806
, , ,
1Robert Lurie Comprehensive Cancer Center and Department of Dermatology, Feinberg School of Medicine,Northwestern University, 2Department of Pathology,University of Illinois at Chicago, 3Department of Microbiology and Immunology, Feinberg School of Medicine,Northwestern University

Summary

우리는 냉동 된 조직에 다중 스펙트럼 이미징을 수행하는 빠른 염색 방법을 설명합니다.

Abstract

포르말린 고정 파라핀 임베디드(FFPE) 조직에 대한 다스펙트럼 형광 이미징을 통해 단일 조직 샘플에서 여러 마커를 검출할 수 있어 마커의 항원 공발 및 공간 분포에 대한 정보를 제공할 수 있습니다. 그러나, 포르말린 고정 조직에 적합한 항체의 부족은 검출될 수 있는 마커의 성질을 제한할 수 있다. 또한, 염색 방법은 시간이 많이 걸립니다. 여기에서 우리는 동결된 조직에 다중 스펙트럼 형광 화상 진찰을 능력을 발휘하는 급속한 방법을 기술합니다. 이 방법은 사용되는 형광공 조합, 마우스 및 인간 냉동 조직의 염색을 위한 상세한 단계, 및 스캐닝, 획득 및 분석 절차를 포함한다. 염색 분석을 위해 시판되는 반자동 다스펙트럼 형광 이미징 시스템이 사용됩니다. 이 방법을 통해, 단일 냉동 조직 섹션에서 최대 6개의 상이한 마커를 염색하고 검출하였다. 기계 학습 분석 소프트웨어는 정량 분석에 사용될 수 있는 표현형 세포를 표현할 수 있다. 동결 된 조직에 대해 여기에 설명된 방법은 FFPE 조직에서 검출 할 수 없거나 항체가 FFPE 조직에 사용할 수없는 마커의 검출에 유용합니다.

Introduction

현미경 화상 진찰 기술에 있는 최근 어드밴스는 생물학 프로세스 및 질병 상태의 우리의 지식 그리고 이해를 현저하게 향상했습니다. 염색체 면역 조직 화학 (IHC)를 통해 조직에 있는 단백질의 situ 탐지에서는 병리학에서 일상적으로 수행됩니다. 그러나, 발색성 IHC 염색을 이용한 다중 마커의 검출은 다중 면역형광(mIF) 염색 접근법을 사용하는1가지 및 새로운 방법이며, 여기서 다중 생물학적 마커는 단일 조직 샘플에 표지되고, 개발되고 있다. 다중 생물학적 마커의 검출은 조직 구조, 세포의 공간 분포 및 항원 공생과 관련된 정보가 모두 단일 조직 샘플2에서포착되기 때문에 유용하다. 다중 스펙트럼 형광 화상 진찰 기술의 사용은 다중 생물학 마커의 검출가능하게 했습니다. 이 기술에서는, 특정 광학을 사용하여 각 개별 형광공의 형광 스펙트럼을 분리하거나 “혼합되지 않은”, 어떤 스펙트럼 크로스토크 없이 다중 마커의 검출을 가능하게한다 3. 다스펙트럼 형광 이미징은 세포 생물학, 전임상 약물 개발, 임상 병리학 및 종양 면역 프로파일링4,,5,,6에서중요한 접근법이 되고 있다. 중요하게도, 면역 세포(특히 CD8 T 세포)의 공간 분포는 기존 종양을 가진 환자에 대한 예후 인자로서 작용할 수 있다7.

멀티플렉스 형광 염색에 대한 다양한 접근법이 개발되어 동시에 또는 순차적으로 수행될 수 있습니다. 동시 염색 방법에서, 모든 항체는 조직을 라벨링하는 단일 단계에서 칵테일로서 함께 첨가된다. UltraPlex 기술은 융동포극성 1차 항체의 칵테일을 사용하고, 그 다음에 는 형광공화 항체-합텐 이차 항체의 칵테일을 사용합니다. InSituPlex 기술8은 조직에 동시에 첨가되는 독특한 DNA 공액 1차 항체의 칵테일을 사용하여 증폭 단계와 최종적으로 1차 항체상에서 각각의 독특한 DNA 서열에 상보적인 플루오로포폴화 결합 프로브를 사용한다. 이 두 가지 기술은 핵 염색을 위한 4개의 마커와 4′, 6-다이아미노-2-페닐린들레(DAPI)를 검출할 수 있게 합니다. 동시 멀티플렉스 염색을 위한 두 가지 다른 접근법은 이차 이온 질량분석9를기반으로 한다. 하이페리온 이미징 시스템은 이미징 질량 세포 분석10을 사용하여 최대 37개의 마커를 감지합니다. 이 기술은 금속 공액 항체의 칵테일을 사용하여 조직을 염색하고 조직의 특정 영역은 레이저에 의해 압산되어 금속 이온이 검출되는 질량 세포계로 옮겨지습니다. 또 다른 유사한 기술은 다중 이온 빔 이미징 기술11을사용하는 IONPath입니다. 이 기술은 금속 공액 항체를 제거하기 위해 레이저 대신 수정된 질량 분석 기기와 산소 이온 소스를 사용합니다. 이러한 모든 동시 멀티플렉스 염색 접근법은 여러 마커의 검출을 가능하게 하는 반면, 항체에 DNA, 합텐 또는 금속을 결합시키는 데 수반되는 비용, 절제로 인한 조직의 손실 및 혼합을 위한 광범위한 이미지 처리를 과소평가할 수 없습니다. 또한 키트 및 염색 프로토콜은 현재 FFPE 조직에서만 사용할 수 있으며 사용자 지정 패널을 개발하는 것은 추가 시간과 지출을 수반합니다.

이와 는 대조적으로 순차적 멀티플렉스 염색 방법은 하나의 마커에 항체로 조직을 라벨링하고, 항체를 제거하기 위해 스트립을 하고, 이 과정의 순차적 반복을 통해 다중마커(12)를표지하는 것을 포함한다. 티라미드 신호 증폭(TSA)은 가장 자주 사용되는 순차 적중 법입니다. 다른 두 개의 멀티플렉싱 기술은 동시 및 순차적 염색 방법의 조합을 사용합니다. CODEX 플랫폼13은 색인 된 중합 단계를 사용하여 결국 불소로 표지되는 독특한 DNA 올리고뉴클레오티드 서열에 결합된 항체의 칵테일을 채택하고 이미징, 스트립 및 반복하여 최대 50개의 마커를 검출하는 과정을 반복한다. MultiOmyx 멀티플렉스 염색 접근법14는 3~4개의 형광공형 항체의 칵테일로 염색을 반복하고, 형광을 담금질하고, 이 주기를 반복하여 단일 섹션에서 최대 60개의 마커를 검출한다. 동시 멀티플렉스 염색 방법과 유사하게 광범위한 마커를 검출할 수 있지만 염색, 이미지 수집, 처리 및 분석에 수반되는 시간은 광범위합니다. 스트리핑/담금질 단계는 가열 및/또는 조직 견본을 표백하는 관련시키고, 이렇게, 순차적인 다중 배차 염색 접근은 가열 또는 표백시 조직 무결성을 유지하는 FFPE 조직에 일반적으로 수행됩니다.

포르말린 고정 및 후속 파라핀 삽입은 임상 환경에서 용이하게 수행되고, 조직 블록은 저장이 용이하며, 여러 멀티플렉스 염색 프로토콜을 사용할 수 있다. 그러나, FFPE 조직의 처리, 포함 및 탈파화뿐만 아니라 항원회수(15)는항체가 에피토프에 더 잘 접근할 수 있는 과정은 시간이 많이 걸린다. 더욱이, FFPE 조직에 관여하는 처리는자가형광(16) 및 마스크 표적 에피토프에 기여하며, 그 결과 FFPE 조직17,,18,,19에서항원을 검출할 수 있는 항체 클론의 가변성 및 결여를 초래한다. 일례로 인간 백혈구 항원(HLA) 클래스 I Alleles20이다. 대조적으로, 조직의 스냅 동결은 항원회수(21,,22)의필요성을 우회하고, 광범위한 표적을 검출하는 데 유익하게 하기 전 또는 후에 광범위한 처리 단계를 수반하지 않는다. 따라서 다스펙트럼 형광 이미징에 냉동 조직을 사용하여 전임상 및 임상 연구를 위한 표적을 검출하는 것이 유용할 수 있습니다.

FFPE 조직을 사용할 때 위에서 언급 한 한계를 감안할 때, 우리는 다중 스펙트럼 형광 이미징이 냉동 조직에서 수행 될 수 있는지 여부를 물었다. 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 여러 항원을 검출하기 위해 형광 공조 항체의 패널을 사용하여 동시 멀티 플렉스 염색 방법을 테스트하고 반자동 다중 스펙트럼 이미징 시스템을 사용하여 염색을 분석했다. 우리는 90 분 안에 단 하나 조직 단면도에 있는 6개의 마커까지 동시에 얼룩을 수 있었습니다.

Protocol

마우스 비장 및 HLF16 마우스 종양조직(23)은 당사의 실험실로부터 수득되었다. 인간 편도선 조직은 상용 공급 업체로부터 구입되었습니다. 자세한 내용은 재료 표에제공됩니다. 1. 조직 포함 OCT (최적의 절삭 온도) 용액에 신선한 조직을 포함하고 드라이 아이스 또는 액체 질소를 사용하여 동결을 스냅. 조직을 -80 °C에서 보관하십시…

Representative Results

냉동 비장 섹션에서 단일 염색 마커 검출반자동 이미징 시스템은 더 넓은 범위의 파장검출(25)을가능하게 하는 액정 튜닝 필터(LCTF) 시스템을 사용하며, 여기서 신호 증폭 단계가 수행되지 않기 때문에 현미경의 각 마커에 대한 1차 공액 항체의 검출을 먼저 최적화했습니다. 그림 1에는각 단일 염색 마커가 의사 색상의 빨간색인 예가 나와 있?…

Discussion

냉동 조직은 MIF 이미징을 위해 광범위하게 사용되어 왔으며 전통적으로 직접 및 간접 방법32를사용하여 조직에 3~4개의마커(31)를 검출하였다. 직접적인 방법에서, 항체는 조직을 표지하기 위하여 형광 염료 또는양자점(33)에 공액되고, 반면 간접적인 방법에서는, 비공액 1차 항체는 1차 항체를 특이적으로 인식하는 형광공 결합이차 항체에 선행…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

화상 진찰 및 분석 지도는 연구 자원 센터에 의해 제공되었습니다 – 연구 조직학 및 시카고에 있는 일리노이 대학에 있는 조직 화상 진찰 코어는 연구를 위한 부총장의 사무실에서 지원으로 설치했습니다. 이 작품은 NIH/NCI RO1CA11317에 의해 CLP에, NIH/NIAMS (SBDRC 교부금 1P30AR075049-01)에 의해 A. Paller 박사에게, 그리고 노스웨스턴 대학의 면역 요법 평가 코어에 로버트 H. 루리 종합 암 센터의 지원에 의해 지원되었습니다.

Materials

Acetone (histological grade) Fisher Scientific A16F-1GAL Fixing tissues
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 BioLegend 100212 Clone – 17A2; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 488, eBioscience anti-human CD20 ThermoFisher Scientific 53-0202-82 Clone – L26; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 555 Mouse anti-Ki-67 BD Biosciences 558617 Primary conjugated antibody
Alexa Fluor 594 anti-human CD3 BioLegend 300446 Clone – UCHT1; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 594 anti-mouse CD8a BioLegend 100758 Clone – 53-6.7; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 647 anti-human CD8a BioLegend 372906 Clone – C8/144B; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD206 (MMR) BioLegend 141711 Clone – C068C2; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD4 Antibody BioLegend 100426 Clone – GK1.5; primary conjugated antibody
C57BL/6 Mouse Charles River Laboratories 27 Mouse frozen tissues used for multispectral training
Coplin Jar Sigma Aldrich S6016-6EA Rehydrating and washing slides
DAPI Solution BD Biosciences 564907 Nucleic Acid stain
Diamond White Glass Charged Slides DOT Scientific DW7590W Adhering tissue sections
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x (without Ca and Mg) Fisher Scientific MT21031CV Washing and diluent
Gold Seal Cover Slips ThermoFisher Scientific 3306 Protecting stained tissues
Human Normal Tonsil OCT frozen tissue block AMSBio AMS6023 Human frozen tissue used for multispectral staining
Human Serum 1X Gemini Bio-Products 100-512 Blocking and diluent for human tissues
inForm Akoya Biosciences Version 2.4.1 Machine learning software
PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD4 BioLegend 300529 Clone – RPA-T4; primary conjugated antibody
PerCP-Cy 5.5 Rat Anti-CD11b BD Biosciences 550993 Clone – M1/70; primary conjugated antibody
Phenochart Akoya Biosciences Version 1.0.8 Whole slide scan software
ProLong Diamond Antifade Mountant ThermoFisher Scientific P36965 Mounting medium
Research Cryostat Leica Biosystems CM3050 S Sectioning tissues
Superblock 1X ThermoFisher Scientific 37515 Blocking mouse tissues
Tissue-Tek O.C.T Solution Sakura Finetek 4583 Embedding tissues
Vectra 3.0 Automated Quantitative Pathology Imaging System, 6 Slide Akoya Biosciences CLS142568 Semi-automated multispectral imaging system
Vectra Software Akoya Biosciences Version 3.0.5 Software to operate microscope
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Jaishankar, D., Cosgrove, C., Deaton, R. J., Le Poole, I. C. A Rapid Method for Multispectral Fluorescence Imaging of Frozen Tissue Sections. J. Vis. Exp. (157), e60806, doi:10.3791/60806 (2020).
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