JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Immunology and Infection

En hurtig metode til multispektral fluorescensbilleddannelse af frosne vævssektioner

Published: March 30, 2020
doi:
10.3791/60806
, , ,
1Robert Lurie Comprehensive Cancer Center and Department of Dermatology, Feinberg School of Medicine,Northwestern University, 2Department of Pathology,University of Illinois at Chicago, 3Department of Microbiology and Immunology, Feinberg School of Medicine,Northwestern University

Summary

Vi beskriver en hurtig farvningmetode til at udføre multispektral billeddannelse på frosset væv.

Abstract

Multispektraderende fluorescensbilleddannelse på formalin-fast paraffin-indlejret (FFPE) væv gør det muligt at påvise flere markører i en enkelt vævsprøve, der kan give oplysninger om antigen samekspression og rumlig fordeling af markørerne. Manglen på egnede antistoffer mod formalinfast væv kan dog begrænse arten af markører, der kan påvises. Desuden er farvningsmetoden tidskrævende. Her beskriver vi en hurtig metode til at udføre multispektral fluorescensscanning på frosset væv. Metoden omfatter fluorophore kombinationer, der anvendes, detaljerede trin til farvning af mus og menneskelige frosne væv, og scanning, erhvervelse og analyse procedurer. Til farvningsanalyse anvendes et kommercielt tilgængeligt halvautomatisk multispektral fluorescensbilledsystem. Ved hjælp af denne metode blev op til seks forskellige markører farves og detekteret i en enkelt frossen vævssektion. Machine learning analysis software kan fænotypeceller, der kan bruges til kvantitativ analyse. Den metode, der er beskrevet her for frosset væv, er nyttig til påvisning af markører, der ikke kan påvises i FFPE-væv, eller for hvilke der ikke er antistoffer til rådighed for FFPE-væv.

Introduction

De seneste fremskridt inden for mikroskopiske billeddannelsesteknikker har forbedret vores viden og forståelse af biologiske processer og sygdomstilstande betydeligt. In situ påvisning af proteiner i væv via kromoogen immunhistokemi (IHC) udføres rutinemæssigt i patologi. Påvisning af flere markører ved hjælp af kromoogen IHC-farvning er imidlertid udfordrende1, og nyere metoder til anvendelse af multiplex immunofluorescens (mIF) farvningsmetoder, hvor flere biologiske markører er mærket på en enkelt vævsprøve, er under udvikling. Påvisning af flere biologiske markører er nyttig, fordi oplysninger om vævsarkitektur, rumlig fordeling af celler og antigen-samekspression alle er fanget i en enkelt vævsprøve2. Brugen af multispektral fluorescensbilleddannelsesteknologi har gjort det muligt at påvise flere biologiske markører. Ved hjælp af specifik optik kan fluorescenssen for hver enkelt fluorophore adskilles eller “ublandede”, hvilket gør det muligt at påvise flere markører uden spektralkrydstale3. Multispektraderende fluorescens imaging er ved at blive en kritisk tilgang i cellebiologi, præklinisk lægemiddeludvikling, klinisk patologi, og tumor immun-profilering4,5,6. Vigtigere er det, den spacial fordeling af immunceller (specielt CD8 T-celler) kan tjene som en prognosefaktor for patienter med eksisterende tumorer7.

Forskellige tilgange til multiplex fluorescens farvning er blevet udviklet og kan udføres enten samtidigt eller sekventialt. I den samtidige farvningsmetode tilsættes alle antistofferne sammen som en cocktail i et enkelt trin for at mærke vævet. UltraPlex-teknologi bruger en cocktail af hapten-konjugerede primære antistoffer efterfulgt af en cocktail af fluorophore-konjugerede anti-hapten sekundære antistoffer. InSituPlex teknologi8 bruger en cocktail af unikke DNA-konjugerede primære antistoffer, der samtidig føjes til vævet efterfulgt af en forstærkning trin og endelig fluorophore-konjugerede sonder, der supplerer hver unik DNA-sekvens på det primære antistof. Begge disse teknologier gør det muligt at påvise fire markører plus 4′,6-diamino-2-phenylindole (DAPI) til nuklear farvning. To andre metoder til samtidig multiplexfarvning er baseret på sekundært ionmassespektrometri9. Hyperion Imaging System bruger billeddannelse masse cytometri10 til at opdage op til 37 markører. Denne teknologi bruger en cocktail af metal-konjugerede antistoffer til pletter væv, og specifikke områder af væv er ablated af en laser og overføres til en masse cytometer, hvor metalioner detekteres. En anden lignende teknologi er IONPath, som bruger multiplexed ion stråle imaging teknologi11. Denne teknologi bruger et modificeret massespektrometriinstrument og en iltionskilde i stedet for laser til at ablatede de metalkonjugerede antistoffer. Mens alle disse samtidige multiplex farvning tilgange gør det muligt at påvise flere markører, omkostningerne forbundet med konjugering DNA, haptens, eller metaller til antistoffer, tab af væv på grund af ablation, og den omfattende billedbehandling for unmixing kan ikke undervurderes. Desuden er kits og farvningprotokoller i øjeblikket kun tilgængelige for FFPE-væv, og udvikling af brugerdefinerede paneler medfører yderligere tid og udgifter.

Den sekventielle multiplex farvning metode, derimod, omfatter mærkning af vævet med et antistof til en markør, stripning at fjerne antistoffet, efterfulgt af sekventielle gentagelser af denne proces til at mærke flere markører12. Forstærkningen af tyramidsignalet (TSA) er den hyppigst anvendte sekventielle multipleksingmetode. To andre multipleksing teknologier bruger en kombination af samtidige og sekventielle farvning metoder. CODEX-platformen13 anvender en cocktail af antistoffer, der er konjugeret til unikke DNA-oligonukleotidsekvenser, der i sidste ende mærkes med en fluorophore ved hjælp af et indekseret polymeriseringstrin efterfulgt af billeddannelse, stripning og gentagelse af processen for at detektere op til 50 markører. MultiOmyx multiplex-farvningsmetoden14 er en gentagelse af farvning med en cocktail af tre til fire fluorophore-konjugerede antistoffer, billeddannelse, dæmpning af fluorophores og gentagelse af denne cyklus for at detektere op til 60 markører på en enkelt sektion. Svarende til den samtidige multiplex farvning metode, mens en bred vifte af markører kan detekteres, den tid, der er involveret i farvning, billede erhvervelse, behandling og analyse er omfattende. Stripping / quenching trin indebærer opvarmning og / eller blegning af vævsprøve og dermed den sekventielle multiplex farvning tilgang er almindeligt udført på FFPE væv, der opretholder væv integritet ved opvarmning eller blegning.

Formalin fiksering og efterfølgende paraffin indlejring er let udføres i en klinisk indstilling, væv blokke er nemme at gemme, og flere multiplex farvning protokoller er tilgængelige. Men, behandling, indlejring, og deparaffinization af FFPE væv, samt antigen hentning15, en proces, hvorved antistoffer bedre kan få adgang epitoper, er tidskrævende. Desuden bidrager den behandling, der er involveret i FFPE-væv, til autofluorescens16 og masker er rettet mod epitoper, hvilket resulterer i variabilitet og mangel på antistofklon til rådighed til påvisning af antigener i FFPE-væv17,18,19. Et eksempel er det humane leukocytantigen (HLA) klasse I alleler20. I modsætning hertil indebærer fastfrysning af væv ikke omfattende behandlingstrin før eller efter fastsættelse, omgåelse af behovet for antigenudtagning21,22og gør det gavnligt at påvise en bredere vifte af mål. Derfor kan det være værdifuldt at bruge frosset væv til multispektral fluorescensscanning til at påvise mål for prækliniske og kliniske undersøgelser.

I betragtning af ovennævnte begrænsninger ved brug af FFPE-væv spurgte vi, om multispektral fluorescensbilleddannelse kan udføres på frosset væv. For at løse dette spørgsmål, vi testede en samtidig multiplex farvning metode ved hjælp af et panel af fluorophore-konjugerede antistoffer til at opdage flere antigener og analyseret farvning ved hjælp af en semiautomated multispektral imaging system. Vi var i stand til samtidig plette op til seks markører i en enkelt vævssektion inden for 90 min.

Protocol

Mus milt og HLF16 mus tumor væv23 blev fremstillet fra vores laboratorium. Human tonsil væv blev købt fra en kommerciel leverandør. Nærmere oplysninger findes i materialetabellen. 1. Indlejring af væv Integrer frisk væv i OCT (optimal skæretemperatur) opløsning og snap fryse ved hjælp af enten tøris eller flydende nitrogen. Opbevar væv ved -80 °C. 2. Kryosektion Skær 8 μm sek…

Representative Results

Påvisning af enkeltfarvede markører på frosne miltsektionerDa det halvautomatiske billedbehandlingssystem bruger et LCTF-system (liquid crystal tunable filter), der giver mulighed for en bredere vifte af bølgelængdedetektering25, og fordi der ikke blev udført signalforstærkningstrin her, optimerede vi først påvisningen af vores primære konjugerede antistoffer for hver markør på mikroskopet. Et eksempel vises i Figur 1, hvor hver enkelt…

Discussion

Frosset væv er i vid udstrækning blevet anvendt til mIF-billeddannelse til traditionelt at detektere tre til fire markører31 på et væv ved hjælp af den direkte og indirekte metode32. I den direkte metode konjugeres antistoffer til fluorescerende farvestoffer eller kvanteprikker33 for at mærke vævet, mens der i den indirekte metode anvendes et ukonjugeret primært antistof til at mærke vævet efterfulgt af et fluorophore-konjugeret sekundært…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Imaging og analyse vejledning blev leveret af Research Resources Center – Research Histology og Tissue Imaging Core ved University of Illinois i Chicago etableret med støtte fra kontoret for vicekansler for forskning. Arbejdet blev støttet af NIH/NCI RO1CA191317 til CLP, af NIH/NIAMS (SBDRC grant 1P30AR075049-01) til Dr. A. Paller, og med støtte fra Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center til Immunotherapy Assessment Core på Northwestern University.

Materials

Acetone (histological grade) Fisher Scientific A16F-1GAL Fixing tissues
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 BioLegend 100212 Clone – 17A2; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 488, eBioscience anti-human CD20 ThermoFisher Scientific 53-0202-82 Clone – L26; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 555 Mouse anti-Ki-67 BD Biosciences 558617 Primary conjugated antibody
Alexa Fluor 594 anti-human CD3 BioLegend 300446 Clone – UCHT1; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 594 anti-mouse CD8a BioLegend 100758 Clone – 53-6.7; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 647 anti-human CD8a BioLegend 372906 Clone – C8/144B; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD206 (MMR) BioLegend 141711 Clone – C068C2; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD4 Antibody BioLegend 100426 Clone – GK1.5; primary conjugated antibody
C57BL/6 Mouse Charles River Laboratories 27 Mouse frozen tissues used for multispectral training
Coplin Jar Sigma Aldrich S6016-6EA Rehydrating and washing slides
DAPI Solution BD Biosciences 564907 Nucleic Acid stain
Diamond White Glass Charged Slides DOT Scientific DW7590W Adhering tissue sections
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x (without Ca and Mg) Fisher Scientific MT21031CV Washing and diluent
Gold Seal Cover Slips ThermoFisher Scientific 3306 Protecting stained tissues
Human Normal Tonsil OCT frozen tissue block AMSBio AMS6023 Human frozen tissue used for multispectral staining
Human Serum 1X Gemini Bio-Products 100-512 Blocking and diluent for human tissues
inForm Akoya Biosciences Version 2.4.1 Machine learning software
PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD4 BioLegend 300529 Clone – RPA-T4; primary conjugated antibody
PerCP-Cy 5.5 Rat Anti-CD11b BD Biosciences 550993 Clone – M1/70; primary conjugated antibody
Phenochart Akoya Biosciences Version 1.0.8 Whole slide scan software
ProLong Diamond Antifade Mountant ThermoFisher Scientific P36965 Mounting medium
Research Cryostat Leica Biosystems CM3050 S Sectioning tissues
Superblock 1X ThermoFisher Scientific 37515 Blocking mouse tissues
Tissue-Tek O.C.T Solution Sakura Finetek 4583 Embedding tissues
Vectra 3.0 Automated Quantitative Pathology Imaging System, 6 Slide Akoya Biosciences CLS142568 Semi-automated multispectral imaging system
Vectra Software Akoya Biosciences Version 3.0.5 Software to operate microscope
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. van der Loos, C. M. Chromogens in Multiple Immunohistochemical Staining Used for Visual Assessment and Spectral Imaging: The Colorful Future. Journal of Histotechnology. 33 (1), 31-40 (2010).
  2. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  3. Bian, L., et al. Multispectral imaging using a single bucket detector. Scientific Reports. 6, 24752 (2016).
  4. Zhou, L., El-Deiry, W. S. Multispectral fluorescence imaging. Journal of Nuclear Medicine. 50 (10), 1563-1566 (2009).
  5. Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
  6. Wickenhauser, C., Pico de Coaña, Y., et al. . Immune Checkpoint Blockade: Methods and Protocols. , 13-31 (2019).
  7. Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 3 (1), 47 (2015).
  8. Manesse, M., Patel, K. K., Bobrow, M., Downing, S. R. The InSituPlex((R)) Staining Method for Multiplexed Immunofluorescence Cell Phenotyping and Spatial Profiling of Tumor FFPE Samples. Methods in Molecular Biology. 2055, 585-592 (2020).
  9. Gamble, L. J., Anderton, C. R. Secondary Ion Mass Spectrometry Imaging of Tissues, Cells, and Microbial Systems. Microscopy Today. 24 (2), 24-31 (2016).
  10. Giesen, C., et al. Highly multiplexed imaging of tumor tissues with subcellular resolution by mass cytometry. Nature Methods. 11 (4), 417-422 (2014).
  11. Angelo, M., et al. Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors. Nature Medicine. 20 (4), 436-442 (2014).
  12. Tsujikawa, T., et al. Quantitative Multiplex Immunohistochemistry Reveals Myeloid-Inflamed Tumor-Immune Complexity Associated with Poor Prognosis. Cell Reports. 19 (1), 203-217 (2017).
  13. Goltsev, Y., et al. Deep Profiling of Mouse Splenic Architecture with CODEX Multiplexed Imaging. Cell. 174 (4), 968-981 (2018).
  14. Gerdes, M. J., et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11982-11987 (2013).
  15. Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 39 (6), 741-748 (1991).
  16. Viegas, M. S., Martins, T. C., Seco, F., do Carmo, A. An improved and cost-effective methodology for the reduction of autofluorescence in direct immunofluorescence studies on formalin-fixed paraffin-embedded tissues. European Journal of Histochemistry. 51 (1), 59-66 (2007).
  17. Sorensen, I. V., et al. Characterization of anti-TIMP-1 monoclonal antibodies for immunohistochemical localization in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 54 (10), 1075-1086 (2006).
  18. Parra, E. R., Villalobos, P., Mino, B., Rodriguez-Canales, J. Comparison of Different Antibody Clones for Immunohistochemistry Detection of Programmed Cell Death Ligand 1 (PD-L1) on Non-Small Cell Lung Carcinoma. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 26 (2), 83-93 (2018).
  19. Boger, C., Kalthoff, H., Goodman, S. L., Rocken, C. Validation and comparison of anti-alphavbeta3 and anti-alphavbeta5 rabbit monoclonal versus murine monoclonal antibodies in four different tumor entities. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 21 (6), 553-560 (2013).
  20. Torigoe, T., et al. Establishment of a monoclonal anti-pan HLA class I antibody suitable for immunostaining of formalin-fixed tissue: unusually high frequency of down-regulation in breast cancer tissues. Pathology International. 62 (5), 303-308 (2012).
  21. Dapson, R. W. Macromolecular changes caused by formalin fixation and antigen retrieval. Biotechnic & Histochemistry. 82 (3), 133-140 (2007).
  22. Sompuram, S. R., Vani, K., Hafer, L. J., Bogen, S. A. Antibodies Immunoreactive With Formalin-Fixed Tissue Antigens Recognize Linear Protein Epitopes. American Journal of Clinical Pathology. 125 (1), 82-90 (2006).
  23. Cassetti, M. C., et al. Antitumor efficacy of Venezuelan equine encephalitis virus replicon particles encoding mutated HPV16 E6 and E7 genes. Vaccine. 22 (3-4), 520-527 (2004).
  24. Kiernan, J. A. Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice, 3rd Edition. Shock. 12 (6), 479 (1999).
  25. Favreau, P., et al. Thin-film tunable filters for hyperspectral fluorescence microscopy. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 011017 (2014).
  26. van Kempen, M. J., Rijkers, G. T., Van Cauwenberge, P. B. The immune response in adenoids and tonsils. International Archives of Allergy and Immunology. 122 (1), 8-19 (2000).
  27. Klein, U., Dalla-Favera, R. Germinal centres: role in B-cell physiology and malignancy. Nature Reviews Immunology. 8 (1), 22-33 (2008).
  28. Eiben, G. L., et al. Establishment of an HLA-A*0201 Human Papillomavirus Type 16 Tumor Model to Determine the Efficacy of Vaccination Strategies in HLA-A*0201 Transgenic Mice. Cancer Research. 62, 5792-5799 (2002).
  29. Gonzalez, H., Hagerling, C., Werb, Z. Roles of the immune system in cancer: from tumor initiation to metastatic progression. Genes & Development. 32 (19-20), 1267-1284 (2018).
  30. Sica, A., Schioppa, T., Mantovani, A., Allavena, P. Tumour-associated macrophages are a distinct M2 polarised population promoting tumour progression: potential targets of anti-cancer therapy. European Jorunal of Cancer. 42 (6), 717-727 (2006).
  31. Au-Granier, C., et al. Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells. Journal of Visualized Experiments. (132), e56606 (2018).
  32. Odell, I. D., Cook, D. Immunofluorescence Techniques. Journal of Investigative Dermatology. 133 (1), 1-4 (2013).
  33. Xing, Y., et al. Bioconjugated quantum dots for multiplexed and quantitative immunohistochemistry. Nature Protocols. 2 (5), 1152-1165 (2007).
  34. Schubert, W., et al. Analyzing proteome topology and function by automated multidimensional fluorescence microscopy. Nature Biotechnology. 24 (10), 1270-1278 (2006).
  35. de Vries, N. L., et al. High-dimensional cytometric analysis of colorectal cancer reveals novel mediators of antitumour immunity. Gut. , 03 (2019).
  36. Scalia, C. R., et al. Antigen Masking During Fixation and Embedding, Dissected. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry : Official Journal of the Histochemistry Society. 65 (1), 5-20 (2017).
  37. Sorrelle, N., et al. Improved Multiplex Immunohistochemistry for Immune Microenvironment Evaluation of Mouse Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tissues. Journal of Immunology. 202 (1), 292-299 (2019).
  38. Ackerman, L. V., Ramirez, G. A. The indications for and limitations of frozen section diagnosis; a review of 1269 consecutive frozen section diagnoses. British Journal of Surgery. 46 (198), 336-350 (1959).
  39. Mezheyeuski, A., et al. Multispectral imaging for quantitative and compartment-specific immune infiltrates reveals distinct immune profiles that classify lung cancer patients. The Journal of Pathology. 244 (4), 421-431 (2018).
  40. Feng, Z., et al. Multiparametric immune profiling in HPV- oral squamous cell cancer. JCI insight. 2 (14), 93652 (2017).
  41. Yang, L., Liu, Z., Tan, J., Dong, H., Zhang, X. Multispectral imaging reveals hyper active TGF-β signaling in colorectal cancer. Cancer Biology & Therapy. 19 (2), 105-112 (2018).
  42. Blom, S., et al. Systems pathology by multiplexed immunohistochemistry and whole-slide digital image analysis. Scientific Reports. 7 (1), 15580-15580 (2017).
  43. Roy, S., Axelrod, H. D., Valkenburg, K. C., Amend, S., Pienta, K. J. Optimization of prostate cancer cell detection using multiplex tyramide signal amplification. Journal of Cellular Biochemistry. 120 (4), 4804-4812 (2019).
  44. Vickovic, S., et al. High-density spatial transcriptomics arrays for in situ tissue profiling. bioRxiv. , 563338 (2019).

Tags

Multispectral Fluorescence ImagingBiomarker DetectionCo-localizationRapid Staining MethodSpectral LibraryMachine LearningImage Analysis
check_url/60806?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Jaishankar, D., Cosgrove, C., Deaton, R. J., Le Poole, I. C. A Rapid Method for Multispectral Fluorescence Imaging of Frozen Tissue Sections. J. Vis. Exp. (157), e60806, doi:10.3791/60806 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image