जमे हुए ऊतक वर्गों के मल्टीस्पेक्ट्रल फ्लोरेसेंस इमेजिंग के लिए एक रैपिड विधि
Summary
हम जमे हुए ऊतकों पर बहुनिरीक्षण इमेजिंग करने के लिए एक तेजी से धुंधला विधि का वर्णन करते हैं।
Abstract
फॉर्मेलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड (एफएफपीई) ऊतकों पर बहुस्पेक्ट्रल फ्लोरेसेंस इमेजिंग एक ऊतक नमूने में कई मार्कर का पता लगाने में सक्षम बनाता है जो मार्कर के एंटीजन सहअभिव्यक्ति और स्थानिक वितरण के बारे में जानकारी प्रदान कर सकता है। हालांकि, फॉर्मेलिन-फिक्स्ड ऊतकों के लिए उपयुक्त एंटीबॉडी की कमी मार्कर की प्रकृति को प्रतिबंधित कर सकती है जिसका पता लगाया जा सकता है। इसके अलावा धुंधला तरीका समय लेने वाला होता है। यहां हम जमे हुए ऊतकों पर बहुस्पेक्ट्रल फ्लोरेसेंस इमेजिंग करने के लिए एक त्वरित विधि का वर्णन करते हैं। विधि में इस्तेमाल किए गए फ्लोरोफोर संयोजन, माउस और मानव जमे हुए ऊतकों के धुंधला होने के लिए विस्तृत कदम, और स्कैनिंग, अधिग्रहण और विश्लेषण प्रक्रियाएं शामिल हैं। धुंधला विश्लेषण के लिए, एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अर्धस्वचालित बहुआयामी फ्लोरेसेंस इमेजिंग सिस्टम का उपयोग किया जाता है। इस विधि के माध्यम से, एक ही जमे हुए ऊतक अनुभाग में छह अलग-अलग मार्कर दाग और पाए गए। मशीन लर्निंग एनालिसिस सॉफ्टवेयर फेनोटाइप कोशिकाओं को फेनोटाइप कर सकता है जिसका उपयोग मात्रात्मक विश्लेषण के लिए किया जा सकता है। जमे हुए ऊतकों के लिए यहां वर्णित विधि मार्कर का पता लगाने के लिए उपयोगी है जिसे एफएफपीई ऊतकों में पता नहीं लगाया जा सकता है या जिसके लिए एफएफपीई ऊतकों के लिए एंटीबॉडी उपलब्ध नहीं हैं।
Introduction
सूक्ष्म इमेजिंग तकनीकों में हाल ही में हुई प्रगति ने जैविक प्रक्रियाओं और रोग राज्यों के हमारे ज्ञान और समझ में काफी सुधार किया है। क्रोमोजेनिक इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) के माध्यम से ऊतकों में प्रोटीन का सीटू पता लगाने में नियमित रूप से विकृति में किया जाता है। हालांकि, गुणसूत्र आईएचसी धुंधला का उपयोग कर कई मार्कर का पता लगानेके लिए 1 और नए तरीकों को चुनौती दे रहा है मल्टीप्लेक्स इम्यूनोफ्लोरेसेंस (mIF) धुंधला दृष्टिकोण का उपयोग करें, जिसमें कई जैविक मार्कर एक ही ऊतक नमूने पर लेबल कर रहे हैं, विकसित किया जा रहा है । कई जैविक मार्कर का पता लगाना उपयोगी है, क्योंकि ऊतक वास्तुकला से संबंधित जानकारी, कोशिकाओं का स्थानिक वितरण, और एंटीजन सह-अभिव्यक्ति सभी एक ऊतक नमूना2में कैप्चर किए जाते हैं। बहुप्रतिक्षित फ्लोरेसेंस इमेजिंग तकनीक के उपयोग ने कई जैविक मार्कर का पता लगाना संभव बना दिया है। इस तकनीक में, विशिष्ट प्रकाशिकी का उपयोग करके प्रत्येक व्यक्ति फ्लोरोफोर के फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रा को अलग या “अमिश्रित” किया जा सकता है, जिससे बिना किसी स्पेक्ट्रल क्रॉसटॉक3के कई मार्कर का पता लगाया जा सकता है। मल्टीस्पेक्ट्रल फ्लोरेसेंस इमेजिंग सेल बायोलॉजी, प्रीक्लीनिकल ड्रग डेवलपमेंट, क्लीनिकल पैथोलॉजी और ट्यूमर इम्यून-प्रोफाइलिंग4,5,5,6में एक महत्वपूर्ण दृष्टिकोण बनता जा रहा है। महत्वपूर्ण बात, प्रतिरक्षा कोशिकाओं (विशेष रूप से CD8 टी कोशिकाओं) के स्थानिक वितरण मौजूदा ट्यूमर7के साथ रोगियों के लिए एक शकुन कारक के रूप में काम कर सकते हैं ।
मल्टीप्लेक्स फ्लोरेसेंस धुंधला करने के लिए विभिन्न दृष्टिकोण विकसित किए गए हैं और या तो एक साथ या क्रमिक रूप से किया जा सकता है। एक साथ धुंधला विधि में, सभी एंटीबॉडी ऊतक लेबल करने के लिए एक ही कदम में एक कॉकटेल के रूप में एक साथ जोड़ा जाता है। अल्ट्राप्लेक्स तकनीक हैप्टेन-कॉन्जुरेटेड प्राइमरी एंटीबॉडी के कॉकटेल का उपयोग करती है जिसके बाद फ्लोरोफोर-कॉन्जुलेड एंटी-हैपटेन सेकेंडरी एंटीबॉडी का कॉकटेल होता है। InSituPlex प्रौद्योगिकी8 अद्वितीय डीएनए-conjugated प्राथमिक एंटीबॉडी के एक कॉकटेल का उपयोग करता है जो एक साथ ऊतक में जोड़ा जाता है जिसके बाद एक प्रवर्धन कदम और अंत में फ्लोरोफोर-कॉन्जुगाट जांच होती है जो प्राथमिक एंटीबॉडी पर प्रत्येक अद्वितीय डीएनए अनुक्रम के पूरक हैं। ये दोनों प्रौद्योगिकियां परमाणु धुंधला करने के लिए चार मार्कर प्लस 4′,6-डिमिनो-2-फेनिलिंडोल (डीएपीआई) का पता लगाने में सक्षम बनाती हैं। एक साथ मल्टीप्लेक्स धुंधला करने के लिए दो अन्य दृष्टिकोण माध्यमिक आयन मास स्पेक्ट्रोमेट्री9पर आधारित हैं । हाइपरियन इमेजिंग सिस्टम 37 मार्कर तक का पता लगाने के लिए इमेजिंग मास साइटोमेट्री10 का उपयोग करता है। यह तकनीक ऊतकों को दाग देने के लिए धातु-संयुग्मित एंटीबॉडी के कॉकटेल का उपयोग करती है, और ऊतकों के विशिष्ट क्षेत्रों को लेजर द्वारा बरी किया जाता है और एक बड़े पैमाने पर साइटोमीटर में स्थानांतरित किया जाता है जहां धातु आयनों का पता लगाया जाता है। इसी तरह की एक और तकनीक आयनपाथ है, जो मल्टीप्लेक्स्ड आयन बीम इमेजिंग टेक्नोलॉजी11का इस्तेमाल करती है । यह तकनीक धातु-संयुग्मित एंटीबॉडी को त्यागने के लिए लेजर के बजाय एक संशोधित द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री उपकरण और ऑक्सीजन आयन स्रोत का उपयोग करती है। हालांकि ये सभी एक साथ मल्टीप्लेक्स धुंधला दृष्टिकोण कई मार्कर का पता लगाने में सक्षम होते हैं, डीएनए, हैप्टेन्स या धातुओं को एंटीबॉडी के लिए संयुग्मित करने के लिए शामिल लागत, एब्लेशन के कारण ऊतक ों की हानि, और अमिश्रण के लिए व्यापक छवि प्रसंस्करण को कम करके नहीं आंका जा सकता है। इसके अलावा, किट और धुंधला प्रोटोकॉल वर्तमान में केवल FFPE ऊतकों के लिए उपलब्ध है और कस्टम पैनलों के विकास के अतिरिक्त समय और व्यय पर जोर देता है ।
अनुक्रमिक मल्टीप्लेक्स धुंधला विधि, इसके विपरीत, एक मार्कर के लिए एक एंटीबॉडी के साथ ऊतक लेबलिंग, एंटीबॉडी को हटाने के लिए अलग करना, इस प्रक्रिया के अनुक्रमिक दोहराता के बाद कई मार्कर12लेबल शामिल हैं । टायरामाइड सिग्नल प्रवर्धन (टीएसए) सबसे अधिक बार उपयोग की जाने वाली अनुक्रमिक मल्टीप्लेक्सिंग विधि है। दो अन्य मल्टीप्लेक्सिंग प्रौद्योगिकियां एक साथ और अनुक्रमिक धुंधला तरीकों के संयोजन का उपयोग करती हैं। कोडएक्स प्लेटफॉर्म13 अद्वितीय डीएनए ओलिगोन्यूक्लियोटाइड दृश्यों के लिए संयुग्मित एंटीबॉडी का कॉकटेल कार्यरत है जिसे अंततः इमेजिंग, स्ट्रिपिंग और 50 मार्कर तक का पता लगाने की प्रक्रिया को दोहराने के बाद एक अनुक्रमित बहुलीकरण कदम का उपयोग करके फ्लोरोफोर के साथ लेबल किया जाता है। मल्टीोमेक्स मल्टीप्लेक्स धुंधला दृष्टिकोण14 तीन से चार फ्लोरोफोर-कॉन्जुलेट एंटीबॉडी, इमेजिंग, फ्लोरोफोर्स को बुझाने और एक ही खंड पर 60 मार्कर तक का पता लगाने के लिए इस चक्र को दोहराने के कॉकटेल के साथ धुंधला होने का एक पुनरावृत्ति है। एक साथ मल्टीप्लेक्स धुंधला विधि के समान है, जबकि मार्कर की एक विस्तृत श्रृंखला का पता लगाया जा सकता है, धुंधला, छवि अधिग्रहण, प्रसंस्करण, और विश्लेषण में शामिल समय व्यापक है । अलग-अलग/शमन कदम में ऊतक के नमूने को हीटिंग और/या ब्लीचिंग शामिल है और इस प्रकार, अनुक्रमिक मल्टीप्लेक्स धुंधला दृष्टिकोण आमतौर पर एफएफपीई ऊतकों पर किया जाता है जो हीटिंग या ब्लीचिंग पर ऊतक अखंडता को बनाए रखते हैं ।
फॉर्मेलिन फिक्सेशन और बाद में पैराफिन एम्बेडिंग आसानी से नैदानिक सेटिंग में की जाती है, ऊतक ब्लॉक स्टोर करना आसान होता है, और कई मल्टीप्लेक्स धुंधला प्रोटोकॉल उपलब्ध हैं। हालांकि, एफएफपीई ऊतकों के प्रसंस्करण, एम्बेडिंग और डिपरफिनाइजेशन के साथ-साथ एंटीजन रिट्रीवल15,एक प्रक्रिया जिसके द्वारा एंटीबॉडी बेहतर एपीटोप का उपयोग कर सकते हैं, समय लेने वाली है। इसके अलावा, एफएफपीई ऊतकों में शामिल प्रसंस्करण ऑटोफ्लोरेसेंस16 में योगदान देता है और मास्क एपिटोप को लक्षित करता है, जिसके परिणामस्वरूप एफएफपीई ऊतकों17,,18,,19में एंटीजन का पता लगाने के लिए उपलब्ध एंटीबॉडी क्लोन की परिवर्तनशीलता और कमी होती है। एक उदाहरण मानव ल्यूकोसाइट एंटीजन (एचएलए) वर्ग मैं एलील्स20है। इसके विपरीत, ऊतकों की स्नैप फ्रीजिंग में फिक्सिंग से पहले या बाद में व्यापक प्रसंस्करण चरण शामिल नहीं हैं, एंटीजन पुनर्प्राप्ति21,,22की आवश्यकता को दरकिनार करते हैं, और लक्ष्यों की एक व्यापक श्रृंखला का पता लगाने के लिए इसे फायदेमंद बनाते हैं। इसलिए, बहुप्रतिक्षित फ्लोरेसेंस इमेजिंग के लिए जमे हुए ऊतकों का उपयोग पूर्व नैदानिक और नैदानिक अध्ययनों के लिए लक्ष्यों का पता लगाने के लिए मूल्यवान हो सकता है।
एफएफपीई ऊतकों का उपयोग करते समय उपरोक्त सीमाओं को देखते हुए, हमने पूछा कि क्या जमे हुए ऊतकों पर बहुस्पेक्ट्रल फ्लोरेसेंस इमेजिंग की जा सकती है। इस सवाल का समाधान करने के लिए, हमने कई एंटीजन का पता लगाने के लिए फ्लोरोफोर-कॉन्जुगेरेट एंटीबॉडी के पैनल का उपयोग करके एक साथ मल्टीप्लेक्स धुंधला विधि का परीक्षण किया और एक अर्धस्वचालित बहुस्पेक्ट्रल इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके धुंधला का विश्लेषण किया। हम एक साथ ९० मिनट के भीतर एक ही ऊतक अनुभाग में छह मार्कर को दाग करने में सक्षम थे ।
Protocol
Representative Results
Discussion
मआईफ इमेजिंग के लिए जमे हुए ऊतकों का बड़े पैमाने पर उपयोग किया गया है ताकि प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष विधि32का उपयोग करके ऊतक पर पारंपरिक रूप से तीन से चार मार्कर31 का पता लगाया जा सके । प्?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इमेजिंग और विश्लेषण मार्गदर्शन अनुसंधान संसाधन केंद्र द्वारा प्रदान किया गया था – अनुसंधान विज्ञान और शिकागो में इलिनोइस विश्वविद्यालय में ऊतक इमेजिंग कोर अनुसंधान के लिए कुलपति के कार्यालय से समर्थन के साथ स्थापित किया। इस काम को NIH/NCI RO1CA191317 द्वारा सीएलपी को, NIH/NIAMS (SBDRC अनुदान 1P30AR075049-01) द्वारा डॉ ए पल्लर को, और नॉर्थवेस्टर्न विश्वविद्यालय में इम्यूनोथेरेपी मूल्यांकन कोर के लिए रॉबर्ट एच Lurie व्यापक कैंसर केंद्र के समर्थन से समर्थन किया गया था ।
Materials
| Acetone (histological grade) | Fisher Scientific | A16F-1GAL | Fixing tissues |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 | BioLegend | 100212 | Clone – 17A2; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 488, eBioscience anti-human CD20 | ThermoFisher Scientific | 53-0202-82 | Clone – L26; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 555 Mouse anti-Ki-67 | BD Biosciences | 558617 | Primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 594 anti-human CD3 | BioLegend | 300446 | Clone – UCHT1; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 594 anti-mouse CD8a | BioLegend | 100758 | Clone – 53-6.7; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 647 anti-human CD8a | BioLegend | 372906 | Clone – C8/144B; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse CD206 (MMR) | BioLegend | 141711 | Clone – C068C2; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse CD4 Antibody | BioLegend | 100426 | Clone – GK1.5; primary conjugated antibody |
| C57BL/6 Mouse | Charles River Laboratories | 27 | Mouse frozen tissues used for multispectral training |
| Coplin Jar | Sigma Aldrich | S6016-6EA | Rehydrating and washing slides |
| DAPI Solution | BD Biosciences | 564907 | Nucleic Acid stain |
| Diamond White Glass Charged Slides | DOT Scientific | DW7590W | Adhering tissue sections |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x (without Ca and Mg) | Fisher Scientific | MT21031CV | Washing and diluent |
| Gold Seal Cover Slips | ThermoFisher Scientific | 3306 | Protecting stained tissues |
| Human Normal Tonsil OCT frozen tissue block | AMSBio | AMS6023 | Human frozen tissue used for multispectral staining |
| Human Serum 1X | Gemini Bio-Products | 100-512 | Blocking and diluent for human tissues |
| inForm | Akoya Biosciences | Version 2.4.1 | Machine learning software |
| PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD4 | BioLegend | 300529 | Clone – RPA-T4; primary conjugated antibody |
| PerCP-Cy 5.5 Rat Anti-CD11b | BD Biosciences | 550993 | Clone – M1/70; primary conjugated antibody |
| Phenochart | Akoya Biosciences | Version 1.0.8 | Whole slide scan software |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36965 | Mounting medium |
| Research Cryostat | Leica Biosystems | CM3050 S | Sectioning tissues |
| Superblock 1X | ThermoFisher Scientific | 37515 | Blocking mouse tissues |
| Tissue-Tek O.C.T Solution | Sakura Finetek | 4583 | Embedding tissues |
| Vectra 3.0 Automated Quantitative Pathology Imaging System, 6 Slide | Akoya Biosciences | CLS142568 | Semi-automated multispectral imaging system |
| Vectra Software | Akoya Biosciences | Version 3.0.5 | Software to operate microscope |
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