JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

En snabb metod för multispektrala fluorescensavbildning av frysta vävnadssektioner

Published: March 30, 2020
doi:
10.3791/60806
, , ,
1Robert Lurie Comprehensive Cancer Center and Department of Dermatology, Feinberg School of Medicine,Northwestern University, 2Department of Pathology,University of Illinois at Chicago, 3Department of Microbiology and Immunology, Feinberg School of Medicine,Northwestern University

Summary

Vi beskriver en snabb färgning metod för att utföra multispektrala imaging på frysta vävnader.

Abstract

Multispektrala fluorescensavbildning på formalin-fasta paraffin-inbäddade (FFPE) vävnader gör det möjligt att upptäcka flera markörer i ett enda vävnadsprov som kan ge information om antigen coexpression och rumslig fördelning av markörer. Avsaknaden av lämpliga antikroppar för formalin-fasta vävnader kan dock begränsa arten av markörer som kan detekteras. Dessutom är färgningsmetoden tidskrävande. Här beskriver vi en snabb metod för att utföra multispektrala fluorescens imaging på frysta vävnader. Metoden omfattar fluorofore kombinationer som används, detaljerade steg för färgning av mus och mänskliga frysta vävnader, och skanning, förvärv och analys förfaranden. För färgningsanalys används ett kommersiellt tillgängligt halvautomatiskt multispektralt fluorescensavbildningssystem. Genom denna metod, upp till sex olika markörer var färgas och upptäcktes i en enda fryst vävnad avsnitt. Machine learning-analysprogrammet kan fenotypa celler som kan användas för kvantitativ analys. Den metod som beskrivs här för frysta vävnader är användbar för att upptäcka markörer som inte kan detekteras i FFPE-vävnader eller för vilka antikroppar inte är tillgängliga för FFPE-vävnader.

Introduction

De senaste framstegen inom mikroskopisk avbildning tekniker har avsevärt förbättrat vår kunskap och förståelse för biologiska processer och sjukdomstillstånd. In situ detektion av proteiner i vävnader via kromogena immunohistochemistry (IHC) utförs rutinmässigt i patologi. Detektion av flera markörer med hjälp av kromogenAHC färgning är dock utmanande1 och nyare metoder för att använda multiplex immunofluorescens (mIF) färgning metoder, där flera biologiska markörer är märkta på ett enda vävnadsprov, håller på att utvecklas. Detektion av flera biologiska markörer är användbart, eftersom information om vävnadsarkitektur, rumslig fördelning av celler och antigensamuttryck alla fångas upp i ett enda vävnadsprov2. Användningen av multispektrala fluorescensavbildningsteknik har möjliggjort deteringar av flera biologiska markörer. I denna teknik, med hjälp av specifik optik fluorescensspektra av varje enskild fluorofore kan separeras eller “oblanda”, vilket gör det möjligt att upptäcka flera markörer utan spektrala överhörning3. Multispektrala fluorescens imaging blir en kritisk strategi i cellbiologi, preklinisk läkemedelsutveckling, klinisk patologi, och tumör immun-profilering4,,5,6. Viktigt, den spacial fördelningen av immunceller (särskilt CD8 T-celler) kan fungera som en prognostisk faktor för patienter med befintliga tumörer7.

Olika metoder för multiplexfluorescensfärgning har utvecklats och kan utföras antingen samtidigt eller sekventiellt. I den samtidiga färgningsmetoden tillsätts alla antikroppar tillsammans som en cocktail i ett enda steg för att märka vävnaden. UltraPlex-tekniken använder en cocktail av haptenkonjugerade primära antikroppar följt av en cocktail av fluoroforekonjugerade anti-hapten sekundära antikroppar. InSituPlex-teknik8 använder en cocktail av unika DNA-konjugerade primära antikroppar som samtidigt tillsätts vävnaden följt av ett förstärkningssteg och slutligen fluoroforekonjugerade sonder som kompletterar varje unik DNA-sekvens på den primära antikroppen. Båda dessa tekniker möjliggör detektion av fyra markörer plus 4′,6-diamino-2-fenylindole (DAPI) för kärnfläckning. Två andra metoder för samtidig multiplexfärgning är baserade på sekundär jonmasspektrometri9. Hyperion Imaging System använder imaging massa cytometri10 för att upptäcka upp till 37 markörer. Denna teknik använder en cocktail av metallkonjugerade antikroppar för att färga vävnaderna, och specifika områden i vävnaderna ablated av en laser och överförs till en massa cytometer där metalljoner upptäcks. En annan liknande teknik är IONPath, som använder multiplexerad jonstrålebildteknik11. Denna teknik använder en modifierad masspektrometri instrument och en syrejonkälla i stället för laser för att ablate metallkonjugerade antikroppar. Medan alla dessa samtidiga multiplex färgning metoder möjliggör detektion av flera markörer, kostnaderna för konjugera DNA, haptens, eller metaller till antikroppar, förlust av vävnad på grund av ablation, och omfattande bildbehandling för oblandning kan inte underskattas. Dessutom, kit och färgning protokoll är för närvarande endast tillgängliga för FFPE vävnader och utveckla anpassade paneler medför ytterligare tid och utgifter.

Den sekventiella multiplexfärgningsmetoden omfattar däremot märkning av vävnaden med en antikropp till en markör, strippning för att avlägsna antikroppen, följt av sekventiella upprepningar av denna process för att märka flera markörer12. Tyramidsignalförstärkning (TSA) är den vanligaste sekventiella multiplexeringsmetoden. Två andra multiplexeringstekniker använder en kombination av samtidiga och sekventiella färgningsmetoder. CODEX-plattformen13 använder en cocktail av antikroppar som är konjugerade till unika DNA-oligonukleotidsekvenser som så småningom är märkta med en fluorofore med hjälp av ett indexerat polymerisationssteg följt av bildbehandling, strippning och upprepande av processen för att upptäcka upp till 50 markörer. MultiOmyx multiplex färgning strategi14 är en iteration av färgning med en cocktail av tre till fyra fluoroforekonjugerade antikroppar, imaging, släcka fluorofores, och upprepa denna cykel för att upptäcka upp till 60 markörer på en enda sektion. I likhet med den samtidiga multiplexfärgningsmetoden, medan ett brett spektrum av markörer kan detekteras, är tiden som är involverad i färgning, bildförvärv, bearbetning och analys omfattande. Strippnings-/släckningssteget innebär uppvärmning och/eller blekning av vävnadsprovet och därmed utförs den sekventiella multiplexfärgningsmetoden vanligen på FFPE-vävnader som bibehåller vävnadsintegritet vid uppvärmning eller blekning.

Formalin fixering och efterföljande paraffin inbäddning utförs lätt i en klinisk miljö, vävnad block är lätta att lagra, och flera multiplex färgning protokoll finns tillgängliga. Emellertid, bearbetning, inbäddning och deparaffinisering av FFPE vävnader, samt antigenhämtning 15, en process genom vilken antikroppar bättre kan komma åt epitopes, är tidskrävande. Dessutom bidrar bearbetningen i FFPE-vävnader till autofluorescens16 och masker måleptoper, vilket resulterar i variationer och brist på antikroppsklon tillgängliga för att upptäcka antigener i FFPE-vävnaderna17,,18,19. Ett exempel är human leukocyte antigen (HLA) klass I alleler20. Däremot innebär snap frysning av vävnader inte omfattande bearbetningssteg före eller efter fastställande, kringgå behovet av antigen hämtning21,22, och gör det fördelaktigt för att upptäcka ett bredare spektrum av mål. Därför kan det vara värdefullt att använda frysta vävnader för multispektrala fluorescensavbildning för att upptäcka mål för prekliniska och kliniska studier.

Med tanke på de ovan nämnda begränsningarna vid användning av FFPE vävnader, frågade vi om multispektrala fluorescens imaging kan utföras på frysta vävnader. För att ta itu med denna fråga testade vi en samtidig multiplex färgning metod med hjälp av en panel av fluoroforekonjugerade antikroppar för att upptäcka flera antigener och analyserade färgning med hjälp av en halvautomatad multispektrala bildsystem. Vi kunde samtidigt färga upp till sex markörer i en enda vävnad avsnitt inom 90 min.

Protocol

Mus mjälte och HLF16 mus tumör vävnader23 erhölls från vårt laboratorium. Mänsklig tonsill vävnad köptes från en kommersiell leverantör. Detaljer finns i tabellen över material. 1. Vävnad inbäddning Bädda in färsk vävnad i OCT -lösningen (optimal skärtemperatur) och snäppfrys med antingen torris eller flytande kväve. Lagra vävnader vid -80 °C. 2. Kryosectioning Skär …

Representative Results

Detektion av enfärgade markörer på frysta mjältesektionerEftersom det halvautomatiska bildsystemet använder ett LCTF-system (Liquid Crystal Tunable Filter) som möjliggör ett bredare spektrum av våglängdsdetektering25, och eftersom inga signalförstärkningssteg utfördes här optimerade vi först detektionen av våra primärkonjugerade antikroppar för varje markör på mikroskopet. Ett exempel visas i figur 1, där varje markör med en f…

Discussion

Frysta vävnader har i stor utsträckning använts för mIF-avbildning för att traditionellt upptäcka tre till fyra markörer31 på en vävnad med den direkta och indirekta metoden32. I den direkta metoden konjugeras antikroppar till fluorescerande färgämnen eller kvantprickar33 för att märka vävnaden, medan en okonjugerad primärantikropp i den indirekta metoden används för att märka vävnaden följt av en fluoroforekonjugerad sekundär an…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Imaging och analys vägledning tillhandahölls av Research Resources Center – Forskning Histologi och Tissue Imaging Core vid University of Illinois i Chicago inrättades med stöd från kontoret för vicekansler för forskning. Arbetet stöddes av NIH/NCI RO1CA191317 till CLP, av NIH/NIAMS (SBDRC grant 1P30AR075049-01) till Dr. A. Paller, och med stöd av Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center till Immunotherapy Assessment Core vid Northwestern University.

Materials

Acetone (histological grade) Fisher Scientific A16F-1GAL Fixing tissues
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 BioLegend 100212 Clone – 17A2; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 488, eBioscience anti-human CD20 ThermoFisher Scientific 53-0202-82 Clone – L26; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 555 Mouse anti-Ki-67 BD Biosciences 558617 Primary conjugated antibody
Alexa Fluor 594 anti-human CD3 BioLegend 300446 Clone – UCHT1; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 594 anti-mouse CD8a BioLegend 100758 Clone – 53-6.7; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 647 anti-human CD8a BioLegend 372906 Clone – C8/144B; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD206 (MMR) BioLegend 141711 Clone – C068C2; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD4 Antibody BioLegend 100426 Clone – GK1.5; primary conjugated antibody
C57BL/6 Mouse Charles River Laboratories 27 Mouse frozen tissues used for multispectral training
Coplin Jar Sigma Aldrich S6016-6EA Rehydrating and washing slides
DAPI Solution BD Biosciences 564907 Nucleic Acid stain
Diamond White Glass Charged Slides DOT Scientific DW7590W Adhering tissue sections
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x (without Ca and Mg) Fisher Scientific MT21031CV Washing and diluent
Gold Seal Cover Slips ThermoFisher Scientific 3306 Protecting stained tissues
Human Normal Tonsil OCT frozen tissue block AMSBio AMS6023 Human frozen tissue used for multispectral staining
Human Serum 1X Gemini Bio-Products 100-512 Blocking and diluent for human tissues
inForm Akoya Biosciences Version 2.4.1 Machine learning software
PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD4 BioLegend 300529 Clone – RPA-T4; primary conjugated antibody
PerCP-Cy 5.5 Rat Anti-CD11b BD Biosciences 550993 Clone – M1/70; primary conjugated antibody
Phenochart Akoya Biosciences Version 1.0.8 Whole slide scan software
ProLong Diamond Antifade Mountant ThermoFisher Scientific P36965 Mounting medium
Research Cryostat Leica Biosystems CM3050 S Sectioning tissues
Superblock 1X ThermoFisher Scientific 37515 Blocking mouse tissues
Tissue-Tek O.C.T Solution Sakura Finetek 4583 Embedding tissues
Vectra 3.0 Automated Quantitative Pathology Imaging System, 6 Slide Akoya Biosciences CLS142568 Semi-automated multispectral imaging system
Vectra Software Akoya Biosciences Version 3.0.5 Software to operate microscope
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. van der Loos, C. M. Chromogens in Multiple Immunohistochemical Staining Used for Visual Assessment and Spectral Imaging: The Colorful Future. Journal of Histotechnology. 33 (1), 31-40 (2010).
  2. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  3. Bian, L., et al. Multispectral imaging using a single bucket detector. Scientific Reports. 6, 24752 (2016).
  4. Zhou, L., El-Deiry, W. S. Multispectral fluorescence imaging. Journal of Nuclear Medicine. 50 (10), 1563-1566 (2009).
  5. Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
  6. Wickenhauser, C., Pico de Coaña, Y., et al. . Immune Checkpoint Blockade: Methods and Protocols. , 13-31 (2019).
  7. Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 3 (1), 47 (2015).
  8. Manesse, M., Patel, K. K., Bobrow, M., Downing, S. R. The InSituPlex((R)) Staining Method for Multiplexed Immunofluorescence Cell Phenotyping and Spatial Profiling of Tumor FFPE Samples. Methods in Molecular Biology. 2055, 585-592 (2020).
  9. Gamble, L. J., Anderton, C. R. Secondary Ion Mass Spectrometry Imaging of Tissues, Cells, and Microbial Systems. Microscopy Today. 24 (2), 24-31 (2016).
  10. Giesen, C., et al. Highly multiplexed imaging of tumor tissues with subcellular resolution by mass cytometry. Nature Methods. 11 (4), 417-422 (2014).
  11. Angelo, M., et al. Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors. Nature Medicine. 20 (4), 436-442 (2014).
  12. Tsujikawa, T., et al. Quantitative Multiplex Immunohistochemistry Reveals Myeloid-Inflamed Tumor-Immune Complexity Associated with Poor Prognosis. Cell Reports. 19 (1), 203-217 (2017).
  13. Goltsev, Y., et al. Deep Profiling of Mouse Splenic Architecture with CODEX Multiplexed Imaging. Cell. 174 (4), 968-981 (2018).
  14. Gerdes, M. J., et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11982-11987 (2013).
  15. Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 39 (6), 741-748 (1991).
  16. Viegas, M. S., Martins, T. C., Seco, F., do Carmo, A. An improved and cost-effective methodology for the reduction of autofluorescence in direct immunofluorescence studies on formalin-fixed paraffin-embedded tissues. European Journal of Histochemistry. 51 (1), 59-66 (2007).
  17. Sorensen, I. V., et al. Characterization of anti-TIMP-1 monoclonal antibodies for immunohistochemical localization in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 54 (10), 1075-1086 (2006).
  18. Parra, E. R., Villalobos, P., Mino, B., Rodriguez-Canales, J. Comparison of Different Antibody Clones for Immunohistochemistry Detection of Programmed Cell Death Ligand 1 (PD-L1) on Non-Small Cell Lung Carcinoma. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 26 (2), 83-93 (2018).
  19. Boger, C., Kalthoff, H., Goodman, S. L., Rocken, C. Validation and comparison of anti-alphavbeta3 and anti-alphavbeta5 rabbit monoclonal versus murine monoclonal antibodies in four different tumor entities. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 21 (6), 553-560 (2013).
  20. Torigoe, T., et al. Establishment of a monoclonal anti-pan HLA class I antibody suitable for immunostaining of formalin-fixed tissue: unusually high frequency of down-regulation in breast cancer tissues. Pathology International. 62 (5), 303-308 (2012).
  21. Dapson, R. W. Macromolecular changes caused by formalin fixation and antigen retrieval. Biotechnic & Histochemistry. 82 (3), 133-140 (2007).
  22. Sompuram, S. R., Vani, K., Hafer, L. J., Bogen, S. A. Antibodies Immunoreactive With Formalin-Fixed Tissue Antigens Recognize Linear Protein Epitopes. American Journal of Clinical Pathology. 125 (1), 82-90 (2006).
  23. Cassetti, M. C., et al. Antitumor efficacy of Venezuelan equine encephalitis virus replicon particles encoding mutated HPV16 E6 and E7 genes. Vaccine. 22 (3-4), 520-527 (2004).
  24. Kiernan, J. A. Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice, 3rd Edition. Shock. 12 (6), 479 (1999).
  25. Favreau, P., et al. Thin-film tunable filters for hyperspectral fluorescence microscopy. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 011017 (2014).
  26. van Kempen, M. J., Rijkers, G. T., Van Cauwenberge, P. B. The immune response in adenoids and tonsils. International Archives of Allergy and Immunology. 122 (1), 8-19 (2000).
  27. Klein, U., Dalla-Favera, R. Germinal centres: role in B-cell physiology and malignancy. Nature Reviews Immunology. 8 (1), 22-33 (2008).
  28. Eiben, G. L., et al. Establishment of an HLA-A*0201 Human Papillomavirus Type 16 Tumor Model to Determine the Efficacy of Vaccination Strategies in HLA-A*0201 Transgenic Mice. Cancer Research. 62, 5792-5799 (2002).
  29. Gonzalez, H., Hagerling, C., Werb, Z. Roles of the immune system in cancer: from tumor initiation to metastatic progression. Genes & Development. 32 (19-20), 1267-1284 (2018).
  30. Sica, A., Schioppa, T., Mantovani, A., Allavena, P. Tumour-associated macrophages are a distinct M2 polarised population promoting tumour progression: potential targets of anti-cancer therapy. European Jorunal of Cancer. 42 (6), 717-727 (2006).
  31. Au-Granier, C., et al. Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells. Journal of Visualized Experiments. (132), e56606 (2018).
  32. Odell, I. D., Cook, D. Immunofluorescence Techniques. Journal of Investigative Dermatology. 133 (1), 1-4 (2013).
  33. Xing, Y., et al. Bioconjugated quantum dots for multiplexed and quantitative immunohistochemistry. Nature Protocols. 2 (5), 1152-1165 (2007).
  34. Schubert, W., et al. Analyzing proteome topology and function by automated multidimensional fluorescence microscopy. Nature Biotechnology. 24 (10), 1270-1278 (2006).
  35. de Vries, N. L., et al. High-dimensional cytometric analysis of colorectal cancer reveals novel mediators of antitumour immunity. Gut. , 03 (2019).
  36. Scalia, C. R., et al. Antigen Masking During Fixation and Embedding, Dissected. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry : Official Journal of the Histochemistry Society. 65 (1), 5-20 (2017).
  37. Sorrelle, N., et al. Improved Multiplex Immunohistochemistry for Immune Microenvironment Evaluation of Mouse Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tissues. Journal of Immunology. 202 (1), 292-299 (2019).
  38. Ackerman, L. V., Ramirez, G. A. The indications for and limitations of frozen section diagnosis; a review of 1269 consecutive frozen section diagnoses. British Journal of Surgery. 46 (198), 336-350 (1959).
  39. Mezheyeuski, A., et al. Multispectral imaging for quantitative and compartment-specific immune infiltrates reveals distinct immune profiles that classify lung cancer patients. The Journal of Pathology. 244 (4), 421-431 (2018).
  40. Feng, Z., et al. Multiparametric immune profiling in HPV- oral squamous cell cancer. JCI insight. 2 (14), 93652 (2017).
  41. Yang, L., Liu, Z., Tan, J., Dong, H., Zhang, X. Multispectral imaging reveals hyper active TGF-β signaling in colorectal cancer. Cancer Biology & Therapy. 19 (2), 105-112 (2018).
  42. Blom, S., et al. Systems pathology by multiplexed immunohistochemistry and whole-slide digital image analysis. Scientific Reports. 7 (1), 15580-15580 (2017).
  43. Roy, S., Axelrod, H. D., Valkenburg, K. C., Amend, S., Pienta, K. J. Optimization of prostate cancer cell detection using multiplex tyramide signal amplification. Journal of Cellular Biochemistry. 120 (4), 4804-4812 (2019).
  44. Vickovic, S., et al. High-density spatial transcriptomics arrays for in situ tissue profiling. bioRxiv. , 563338 (2019).

Tags

Multispectral Fluorescence ImagingBiomarker DetectionCo-localizationRapid Staining MethodSpectral LibraryMachine LearningImage Analysis
check_url/60806?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Jaishankar, D., Cosgrove, C., Deaton, R. J., Le Poole, I. C. A Rapid Method for Multispectral Fluorescence Imaging of Frozen Tissue Sections. J. Vis. Exp. (157), e60806, doi:10.3791/60806 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image