Visualisering av östrogenreceptorer i kolon av möss med TNBS-inducerad Crohns sjukdom med immunfluorescens
Summary
Protokollet presenterar en komplett validerad TNBS-inducerad murine modell av Crohns sjukdom och metoder för visualisering av östrogenreceptorer av immunohistochemistry med immunofluorescens av formalin-fast kolon sektioner inbäddade i paraffin.
Abstract
Crohns sjukdom är den mest diagnostiserade typen av inflammatorisk tarmsjukdom. Kronisk inflammation utvecklas i tarmen leder till peristaltik sjukdom och skador på tarmslemhinnan och verkar vara associerad med en ökad risk för kolon neoplastisk omvandling. Ackumulerande bevis tyder på att östrogener och östrogenreceptorer påverkar inte bara hormonkänsliga vävnader, men också andra vävnader som inte är direkt relaterade till östrogener, såsom lungorna eller tjocktarmen. Här beskriver vi protokollet för framgångsrik immunofluorescens färgning av östrogenreceptorer i kolon som erhållits från en murine modell av TNBS-inducerad Crohns sjukdom. Ett detaljerat protokoll för induktion av Crohns sjukdom hos möss och tarmberedning tillhandahålls samt ett steg-för-steg immunohistochemical förfarande med hjälp av formalin-fast paraffin-inbäddade tarmar sektioner. De beskrivna metoderna är inte bara användbara för östrogenreceptordetektion och östrogensignaleringsundersökning in vivo men kan också tillämpas på för andra proteiner som kan vara involverade i utvecklingen av kolit.
Introduction
Crohns sjukdom (CD) är en inflammatorisk tarmsjukdom (IBD) manifesteras som kronisk tarminflammation. Etiologin av CD är dåligt förstås, men det finns några viktiga faktorer som verkar vara ansvarig för CD utveckling, inklusive intestinala mikrobiota, och genetiska och miljömässiga faktorer, såsom kost eller stress1. För en bättre förståelse av patogenesen vid Crohns sjukdom har flera modeller av tarminflammation använts2,3,44,5,6,7. I den här artikeln presenterar vi resultat från en 2,4,6-trinitrobensen sulfonsyra (TNBS)-inducerad murine modell av CD.
Det har dokumenterats att östrogener kan modulera kronisk tarminflammation8,9,10,11,12. Den biologiska aktiviteten hos östrogener medieras av cognate receptorer, bland vilka är nukleära östrogenreceptorer (ERs), dvs ERα (gen ESR1)och ERβ (gen ESR2), samt G protein-kopplade östrogenreceptorn, dvs GPER (gen GPER1), kallad membran-bundna ER13,14. Det finns flera metoder för att bestämma nivån av östrogenreceptorer, men endast ett fåtal kan användas för att visualisera dem i tarmen.
Immunohistochemistry (IHC) är en allmänt använd metod i kliniska och grundläggande studier för påvisande av vissa antigener i celler eller vävnader med fluorokromekonjugerade antikroppar. IHC verkar vara en viktig metod i vävnadsstruktur visualisering, liksom i identifiering och lokalisering av specifika proteiner, vilket kan vara avgörande för att förstå utvecklingen av kolit. Här presenterar vi ett komplett och validerat protokoll för immunohistochemical visualisering av östrogenreceptorer i tarmen med hjälp av immunfluorescens.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det finns många djurmodeller för IBD patofysiologi undersökning, inklusive genetiska, immunologiska eller spontana modeller, samt kemiskt inducerade modeller15. Bland de flera typer av djurmodeller av kolit, kemiskt inducerade modeller såsom TNBS-inducerad modell som beskrivs i detta protokoll, är relativt billiga och lätta att få. Den TNBS-induceradmurine modell av kolit har flera kliniska symtom relaterade till den patologiska grunden för CD. Djur med inducerad kolit kännetecknas av ink…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbetet publicerades tack vare det ekonomiska stödet från lodz universitet: vice rektor för vetenskaplig forskning, rektor för nationellt och internationellt samarbete och dekanus vid fakulteten för biologi och miljöskydd. Damian Jacenik stöddes av bidrag (2017/24/T/NZ5/00045 och 2015/17/N/NZ5/00336) från National Science Centre, Polen.
Materials
| Animals | |||
| BALB/C mice | University of Lodz | NA | |
| Equipment | |||
| Caliper | VWR | 62379-531 | |
| Cardboard block | NA | NA | |
| Confocal microscope – TCS SP8 | Leica Biosystems | NA | |
| Fully automated rotary microtome – RM2255 | Leica Biosystems | NA | |
| Glass slide | Thermo Scientific | J1800BMNT | |
| Heated Paraffin Embedding Module – EG1150 H | Leica Biosystems | NA | |
| Histological box | Marfour | LN.138747 | |
| Hydrophobic pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Laboratory balance | Radwag | WL-104-0048 | |
| LAS X software | Leica Biosystems | NA | |
| Metal mold | Marfour | CP.5105 | |
| Sterile gauze | NA | NA | |
| Sterile scissor | NA | NA | |
| Sterile tweezer | NA | NA | |
| Tissue processor – TP1020 | Leica Biosystems | NA | |
| Reagents | |||
| 2, 4, 6-trinitrobenzene sulfonic acid | Sigma-Aldrich | 92822 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| DiOC6 (3) | Sigma-Aldrich | 318426 | |
| DyLight 650 secondary antibody | Abcam | ab96886 | |
| ERα primary antibody | Abcam | ab75635 | |
| ERβ primary antibody | Abcam | ab3576 | |
| Ethanol | Avantor Performance Materials Poland | 396480111 | |
| Formaldehyde | Avantor Performance Materials Poland | 432173111 | |
| GPER primary antibody | Abcam | ab39742 | |
| Hydrochloric acid | Avantor Performance Materials Poland | 575283421 | |
| Hydrogen peroxidase | Avantor Performance Materials Poland | 885193111 | |
| isoflurane (forane) | Baxter | 1001936040 | |
| Normal goat serum | Gibco | 16210064 | |
| Paraffin | Leica Biosystems | 39602012 | |
| Petrie dish | Nest Scientific | 705001 | |
| Phosphate buffer saline | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Physiological saline | Sigma-Aldrich | 7982 | |
| Primocin (antibiotic) | Invitrogen | ant-pm-1 | |
| ProLong Diamond Antifage Mountant with DAPI (glycerol-based liquid with DAPI) | Invitrogen | P36971 | |
| Sodium chloride | Chempur | WE/231-598-3 | |
| Sodium citrate | Avantor Performance Materials Poland | 795780429 | |
| Tris | Avantor Performance Materials Poland | 853470115 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Xylene | Avantor Performance Materials Poland | BA0860119 |
References
- Zhang, Y. Z., Li, Y. Y. Inflammatory bowel disease: pathogenesis. World Journal of Gastroenterology. 20 (1), 91-99 (2014).
- Morris, G. P., et al. Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon. Gastroenterology. 96 (3), 795-803 (1989).
- Okayasu, I., et al. A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice. Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).
- Boirivant, M., Fuss, I. J., Chu, A., Strober, W. Oxazolone colitis: a murine model of T helper cell type 2 colitis treatable with antibodies to interleukin 4. Journal of Experimental Medicine. 188 (10), 1929-1939 (1998).
- Morrissey, P. J., Charrier, K., Braddy, S., Liggitt, D., Watson, J. D. CD4+ T cells that express high levels of CD45RB induce wasting disease when transferred into congenic severe combined immunodeficient mice. Disease development is prevented by cotransfer of purified CD4+ T cells. Journal of Experimental Medicine. 178 (1), 237-244 (1993).
- Kühn, R., Löhler, J., Rennick, D., Rajewsky, K., Müller, W. Interleukin-10-deficient mice develop chronic enterocolitis. Cell. 75 (2), 263-274 (1993).
- Sundberg, J. P., Elson, C. O., Bedigian, H., Birkenmeier, E. H. Spontaneous, heritable colitis in a new substrain of C3H/HeJ mice. Gastroenterology. 107 (6), 1726-1735 (1994).
- Harnish, D. C., et al. Beneficial effects of estrogen treatment in the HLA-B27 transgenic rat model of inflammatory bowel disease. American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 286 (1), 118-125 (2004).
- Pierdominici, M., et al. Linking estrogen receptor β expression with inflammatory bowel disease activity. Oncotarget. 6 (38), 40443-40451 (2015).
- Włodarczyk, M., et al. G protein-coupled receptor 30 (GPR30) expression pattern in inflammatory bowel disease patients suggests its key role in the inflammatory process. A preliminary study. Journal of Gastrointestinal and Liver Diseases. 26 (1), 29-35 (2017).
- Mohammad, I., et al. Estrogen receptor α contributes to T cell-mediated autoimmune inflammation by promoting T cell activation and proliferation. Science Signaling. 11 (526), eaap9415 (2018).
- Jacenik, D., et al. G protein-coupled estrogen receptor mediates anti-inflammatory action in Crohn’s disease. Scientific Reports. 9 (1), 6749 (2019).
- Prossnitz, E. R., Barton, M. The G protein-coupled estrogen receptor GPER in health and disease. Nature Review Endocrinology. 7 (12), 715-726 (2011).
- Yaşar, P., Ayaz, G., User, S. D., Güpür, G., Muyan, M. Molecular mechanisms of estrogen-estrogen receptor signaling. Reproductive Medicine and Biology. 16 (1), 4-20 (2016).
- Pizarro, T. T., Arseneau, K. O., Bamias, G., Cominelli, F. Mouse models for the study of Crohn’s disease. Trends in Molecular Medicine. 9 (5), 218-222 (2003).
- Neurath, M. F., Fuss, I., Kelsall, B. L., Stüber, E., Strober, W. Antibodies to interleukin 12 abrogate established experimental colitis in mice. Journal of Experimental Medicine. 182 (5), 1281-1290 (1995).
- Ikeda, M., et al. Simvastatin attenuates trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis, but not oxazalone-induced colitis. Digestive Diseases and Sciences. 53 (7), 1869-1875 (2007).
- Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., Ranganathan, K. Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation. Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).
