تصور مستقبلات هرمون الاستروجين في كولونات الفئران مع مرض كرون TNBS الناجم ة باستخدام الفلورسينالمناعي
Summary
يقدم البروتوكول نموذج ًا كاملًا من المورين الناجم عن TNBS من مرض كرون وطرق تصور مستقبلات الإستروجين بواسطة الكيمياء المناعية باستخدام الفلورات المناعية لأقسام القولون الثابتة من formalin المضمنة في البارافين.
Abstract
مرض كرون هو النوع الأكثر تشخيصا من مرض التهاب الأمعاء. التهاب مزمن النامية في الأمعاء يؤدي إلى اضطراب التمعم وتلف الغشاء المخاطي المعوي ويبدو أن يرتبط مع زيادة خطر التحول النيوبلاستيك القولون. تشير الأدلة المتراكمة إلى أن هرمون الاستروجين ومستقبلات الإستروجين لا تؤثر فقط على الأنسجة الحساسة للهرمون ، ولكن أيضًا على الأنسجة الأخرى التي لا ترتبط مباشرة بهرمون الاستروجين ، مثل الرئتين أو القولون. هنا، ونحن نصف بروتوكول لتلطيخ الفلور المناعي الناجح لمستقبلات هرمون الاستروجين في القولون التي تم الحصول عليها من نموذج مورين من مرض كرون الناجم عن TNBS. يتم توفير بروتوكول مفصل لتحريض مرض كرون في إعداد الفئران والأمعاء بالإضافة إلى إجراء مناعي خطوة بخطوة باستخدام أقسام الأمعاء المضمنة بالبارافين الثابتة. الأساليب الموصوفة ليست مفيدة فقط للكشف عن مستقبلات هرمون الاستروجين والاستروجين إشارة التحقيق في الجسم الحي ولكن يمكن أيضا أن تطبق على للبروتينات الأخرى التي قد تشارك في تطوير التهاب القولون.
Introduction
مرض كرون (CD) هو مرض التهاب الأمعاء (IBD) يتجلى التهاب الأمعاء المزمن. لا يفهم مسببات CD بشكل جيد ، ولكن هناك عدد قليل من العوامل الرئيسية التي يبدو أنها مسؤولة عن تطوير CD ، بما في ذلك ميكروبيوتا الأمعاء ، والعوامل الوراثية والبيئية ، مثل النظام الغذائي أو الإجهاد1. من أجل فهم أفضل لإمراض مرض كرون ، تم استخدام عدة نماذج من التهاب الأمعاء2،3،4،5،66،7., في هذه المقالة، نقدم النتائج التي تم الحصول عليها من 2,4,6-trinitrobenzene حمض السلفوين (TNBS) الناجمة عن نموذج المورين من CD.
وقد تم توثيق أن هرمون الاستروجين قادرة على تحوير التهاب الأمعاء المزمن8،9،10،11،12. النشاط البيولوجي لهرمون الاستروجين بوساطة مستقبلات الكونات ، من بينها مستقبلات الإستروجين النووية (ERs) ، أي ERα (جين ESR1)و ERα (جين ESR2)، وكذلك مستقبلات الإستروجين المقترنة بالبروتين G ، أي GPER (جين GPER1)، يشار إليها باسم ER13،14. هناك عدة طرق لتحديد مستوى مستقبلات هرمون الاستروجين، ولكن يمكن استخدام عدد قليل فقط لتصور لهم في الأمعاء.
الكيمياء المناعية (IHC) هي طريقة تستخدم على نطاق واسع في الدراسات السريرية والأساسية للكشف عن بعض المستضدات في الخلايا أو الأنسجة مع الأجسام المضادة المترافقة الفلوروكروم. يبدو أن الـ IHC طريقة مهمة في تصور بنية الأنسجة ، وكذلك في تحديد وتوطين بروتينات محددة ، والتي قد تكون حاسمة لفهم تطور التهاب القولون. هنا ، نقدم بروتوكولًا كاملًا ومصدقًا عليه للتصور المناعي الكيميائي لمستقبلات هرمون الاستروجين في الأمعاء باستخدام الفلورسينس المناعي.
Protocol
Representative Results
Discussion
هناك العديد من النماذج الحيوانية لفحص الفيزيولوجيا المرضية IBD ، بما في ذلك النماذج الوراثية أو المناعية أو العفوية ، وكذلك النماذج المستحثة كيميائيًا15. ومن بين عدة أنواع من النماذج الحيوانية من التهاب القولون، النماذج المستحثة كيميائيا مثل النموذج الناجم عن TNBS الموصوفة في ه…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد نُشر العمل بفضل الدعم المالي الذي تقدمه سلطات جامعة لودز: نائب رئيس الجامعة للبحث العلمي، ونائب رئيس الجامعة للتعاون الوطني والدولي، وعميد كلية البيولوجيا وحماية البيئة. تم دعم داميان جاسينك بمنح (2017/24/T/NZ5/00045 و 2015/17/N/NZ5/NZ5/00336) من المركز الوطني للعلوم، بولندا.
Materials
| Animals | |||
| BALB/C mice | University of Lodz | NA | |
| Equipment | |||
| Caliper | VWR | 62379-531 | |
| Cardboard block | NA | NA | |
| Confocal microscope – TCS SP8 | Leica Biosystems | NA | |
| Fully automated rotary microtome – RM2255 | Leica Biosystems | NA | |
| Glass slide | Thermo Scientific | J1800BMNT | |
| Heated Paraffin Embedding Module – EG1150 H | Leica Biosystems | NA | |
| Histological box | Marfour | LN.138747 | |
| Hydrophobic pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Laboratory balance | Radwag | WL-104-0048 | |
| LAS X software | Leica Biosystems | NA | |
| Metal mold | Marfour | CP.5105 | |
| Sterile gauze | NA | NA | |
| Sterile scissor | NA | NA | |
| Sterile tweezer | NA | NA | |
| Tissue processor – TP1020 | Leica Biosystems | NA | |
| Reagents | |||
| 2, 4, 6-trinitrobenzene sulfonic acid | Sigma-Aldrich | 92822 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| DiOC6 (3) | Sigma-Aldrich | 318426 | |
| DyLight 650 secondary antibody | Abcam | ab96886 | |
| ERα primary antibody | Abcam | ab75635 | |
| ERβ primary antibody | Abcam | ab3576 | |
| Ethanol | Avantor Performance Materials Poland | 396480111 | |
| Formaldehyde | Avantor Performance Materials Poland | 432173111 | |
| GPER primary antibody | Abcam | ab39742 | |
| Hydrochloric acid | Avantor Performance Materials Poland | 575283421 | |
| Hydrogen peroxidase | Avantor Performance Materials Poland | 885193111 | |
| isoflurane (forane) | Baxter | 1001936040 | |
| Normal goat serum | Gibco | 16210064 | |
| Paraffin | Leica Biosystems | 39602012 | |
| Petrie dish | Nest Scientific | 705001 | |
| Phosphate buffer saline | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Physiological saline | Sigma-Aldrich | 7982 | |
| Primocin (antibiotic) | Invitrogen | ant-pm-1 | |
| ProLong Diamond Antifage Mountant with DAPI (glycerol-based liquid with DAPI) | Invitrogen | P36971 | |
| Sodium chloride | Chempur | WE/231-598-3 | |
| Sodium citrate | Avantor Performance Materials Poland | 795780429 | |
| Tris | Avantor Performance Materials Poland | 853470115 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Xylene | Avantor Performance Materials Poland | BA0860119 |
References
- Zhang, Y. Z., Li, Y. Y. Inflammatory bowel disease: pathogenesis. World Journal of Gastroenterology. 20 (1), 91-99 (2014).
- Morris, G. P., et al. Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon. Gastroenterology. 96 (3), 795-803 (1989).
- Okayasu, I., et al. A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice. Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).
- Boirivant, M., Fuss, I. J., Chu, A., Strober, W. Oxazolone colitis: a murine model of T helper cell type 2 colitis treatable with antibodies to interleukin 4. Journal of Experimental Medicine. 188 (10), 1929-1939 (1998).
- Morrissey, P. J., Charrier, K., Braddy, S., Liggitt, D., Watson, J. D. CD4+ T cells that express high levels of CD45RB induce wasting disease when transferred into congenic severe combined immunodeficient mice. Disease development is prevented by cotransfer of purified CD4+ T cells. Journal of Experimental Medicine. 178 (1), 237-244 (1993).
- Kühn, R., Löhler, J., Rennick, D., Rajewsky, K., Müller, W. Interleukin-10-deficient mice develop chronic enterocolitis. Cell. 75 (2), 263-274 (1993).
- Sundberg, J. P., Elson, C. O., Bedigian, H., Birkenmeier, E. H. Spontaneous, heritable colitis in a new substrain of C3H/HeJ mice. Gastroenterology. 107 (6), 1726-1735 (1994).
- Harnish, D. C., et al. Beneficial effects of estrogen treatment in the HLA-B27 transgenic rat model of inflammatory bowel disease. American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 286 (1), 118-125 (2004).
- Pierdominici, M., et al. Linking estrogen receptor β expression with inflammatory bowel disease activity. Oncotarget. 6 (38), 40443-40451 (2015).
- Włodarczyk, M., et al. G protein-coupled receptor 30 (GPR30) expression pattern in inflammatory bowel disease patients suggests its key role in the inflammatory process. A preliminary study. Journal of Gastrointestinal and Liver Diseases. 26 (1), 29-35 (2017).
- Mohammad, I., et al. Estrogen receptor α contributes to T cell-mediated autoimmune inflammation by promoting T cell activation and proliferation. Science Signaling. 11 (526), eaap9415 (2018).
- Jacenik, D., et al. G protein-coupled estrogen receptor mediates anti-inflammatory action in Crohn’s disease. Scientific Reports. 9 (1), 6749 (2019).
- Prossnitz, E. R., Barton, M. The G protein-coupled estrogen receptor GPER in health and disease. Nature Review Endocrinology. 7 (12), 715-726 (2011).
- Yaşar, P., Ayaz, G., User, S. D., Güpür, G., Muyan, M. Molecular mechanisms of estrogen-estrogen receptor signaling. Reproductive Medicine and Biology. 16 (1), 4-20 (2016).
- Pizarro, T. T., Arseneau, K. O., Bamias, G., Cominelli, F. Mouse models for the study of Crohn’s disease. Trends in Molecular Medicine. 9 (5), 218-222 (2003).
- Neurath, M. F., Fuss, I., Kelsall, B. L., Stüber, E., Strober, W. Antibodies to interleukin 12 abrogate established experimental colitis in mice. Journal of Experimental Medicine. 182 (5), 1281-1290 (1995).
- Ikeda, M., et al. Simvastatin attenuates trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis, but not oxazalone-induced colitis. Digestive Diseases and Sciences. 53 (7), 1869-1875 (2007).
- Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., Ranganathan, K. Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation. Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).
