이 프로토콜은 파라핀에 내장된 포르말린 고정 결장 섹션의 면역형광을 이용한 면역성 화학에 의한 에스트로겐 수용체의 시각화 방법 및 크론병의 완전한 검증된 TNBS 유도 뮤린 모델을 제시한다.
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이 논문에서
요약
초록
크론병은 가장 진단된 염증성 장 질환입니다. 장에서 발전하는 만성 염증은 연동 무질서 및 장 점막의 손상으로 이끌어 내고 결장 신생물 변환의 증가한 리스크와 연관되는 것처럼 보입니다. 축적 된 증거는 에스트로겐과 에스트로겐 수용체가 호르몬에 민감한 조직뿐만 아니라 폐 또는 결장과 같은 에스트로겐과 직접 관련이없는 다른 조직에도 영향을 미친다는 것을 나타냅니다. 여기서, 우리는 TNBS 유도 크론병의 뮤린 모델로부터 수득된 결장에서 에스트로겐 수용체의 성공적인 면역형광 염색에 대한 프로토콜을 기술한다. 마우스와 장 제제에서 크론 병의 유도에 대한 상세한 프로토콜뿐만 아니라 포르말린 고정 파라핀 내장 장 절편을 사용하여 단계별 면역 히스토미칼 절차가 제공됩니다. 기술된 방법은 생체 내에서 에스트로겐 수용체 검출 및 에스트로겐 신호 조사뿐만 아니라 대장염의 발달에 관여할 수 있는 다른 단백질에도 적용될 수 있다.
서론
크론병(CD)은 만성 장염증으로 나타나는 염증성 장질환(IBD)입니다. CD의 병인은 제대로 이해되지 않지만, 장내 미생물, 식이 또는 스트레스와 같은 유전적 및 환경적 요인을 포함하여 CD 발달을 담당하는 것으로 보이는 몇 가지 주요 요인이있다 1. 크론 병의 병인을 더 잘 이해하기 위해,장 염증의 여러 모델이2,3,43,5,56,7을사용했습니다. 본 문서에서, 우리는 CD의 2,4,6-트리니트로벤젠 설포닉산(TNBS)-유도 된 뮤린 모델으로부터 얻은 결과를 제시한다.
에스트로겐은 만성 장 염증8,,9,10,,11,,
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프로토콜
동물 연구는 유럽 의회 및 2010년 9월 22일 이사회의 지침 2010/63/EU 및 제도적 권고에 따라 지역 윤리위원회(28/ŁB29/2016)의 동의하에 수행되었습니다.
1. 크론병의 TNBS 유도 뮤린 모델
참고 : 이 프로토콜은 25-28 g의 수컷 BALB / C 마우스를 사용합니다. 동물은 일정한 온도 (22-24 ° C)에 보관되고, 상대 습도 55 ± 5 %, 표준 차우 펠릿 및 수돗물 ad libitum에무료로 액세스 할 수있는 12 시간 빛 / 어두운 주기에서 유지됩니다.
- 마우스를 유도 챔버에 넣고 뚜껑을 단단히 닫습니다. 이소플루란(25%2 O2+1.5-2L/min)으로 마우스를 짧게 마취시다.2
참고: 호흡률은 정상보다 리드미컬하고 느리게 유지되어야 하며 유해한 자극에 반응하여 변하지 않아야 합니다. - 0.9% NaCl에서 0.9% NaCl에서 30% 에탄올의 0.1 mL에 TNBS의 4 mg을 주입하거나 0.9% NaCl에서 0.1% 에탄올의 0.1 mL을 카테터를 통해 말단 결장으로 의한 비히클 제어로.
참고 : 카테터는 항문으로 약 3cm 조심스럽게 도입해야합니다.<....
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결과
TNBS 유도 된 크론 병을 가진 마우스에 있는 결장의 거시적 특성
대조군 및 TNBS 처리 마우스로부터 채취한 결장의 대표적인 이미지는 도 2에나타내고 있다. 크론병의 TNBS 유도 모델을 가진 마우스에서, 결장의 길이는 결장의 폭이 증가하는 동안 감소된다.
도 2: 대조군 마우스(대조군) 및 TNBS 처리 마우스(TNBS)로부터 수득된 대표적인 결장.
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토론
IBD 병리생리학 검사를 위한 수많은 동물 모델들이 있는데, 여기에는 유전적, 면역학적 또는 자발적인 모델뿐만 아니라 화학적으로 유도된모델(15)을포함한다. 대장염의 여러 동물 모델 중에서, 이 프로토콜에 기재된 TNBS 유도 모델과 같은 화학적으로 유도된 모델은 비교적 저렴하고 쉽게 얻을 수 있다. 대장염의 TNBS 유도 뮤린 모델은 CD의 병리학적 기초와 관련된 몇 가지 임상 증상을 갖는다. 유도된 대장염을 가진 동물은 일관되지 않은 발판 대형, 피 묻은 설사 및 체중의 손실을 특징으로 합니다. 그러나, 이것은 이 모형이 CD 병인증을 독점적으로 공부하기 위하여 이용될 수 있다는 것을 의미하지 않습니다. TNBS 유도된 모형은 잠재적인 치료 검열을 위해, 예를 들면, 추천되고 일반적으로 이용됩니다. 화학적으로 유도된 대장염의 경우에 몇몇 중요한 점은 강조될 필요가 있습니다. TNBS는 점막 장벽을 방해하고 TNBS가 장 벽을 관통하고 고분자량 단백질과 상호 작용하도록 허용하는 에탄올.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
작품은 로츠 당국의 재정 지원 덕분에 출판되었다: 과학 연구를위한 부총장, 국가 및 국제 협력을위한 부총장과 생물학 및 환경 보호 학부의 학장. 다미안 제이스닉은 폴란드 국립과학센터의 보조금(2017/24/T/NZ5/00045 및 2015/17/Nz5/00336)을 지원받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Animals | |||
| BALB/C 마우스 | University of Lodz | NA | |
| strong>Equipment | |||
| Caliper | VWR | 62379-531 | |
| 판지 블록 | NA | NA | |
| 컨포칼 현미경 - TCS SP8 | Leica Biosystems | NA | |
| 전자동 회전식 마이크로톰 - RM2255 | Leica Biosystems | NA | |
| Glass slide | Thermo Scientific | J1800BMNT | |
| 가열식 파라핀 임베딩 모듈 - EG1150 | H Leica Biosystems | NA | |
| 조직학 상자 | Marfour | LN.138747 | |
| 소수성 펜 | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| 실험실 저울 | Radwag | WL-104-0048 | |
| LAS X 소프트웨어 | Leica Biosystems | NA | |
| Metal mold | Marfour | CP.5105 | |
| 멸균 거즈 | NA | NA | |
| 멸균 가위 | NA | NA | |
| 멸균 핀셋 | NA | NA 조직 | |
| 프로세서 - TP1020 | Leica Biosystems | NA | |
| strong>Reagents | |||
| 2, 4, 6-trinitrobenzene sulfonic acid | Sigma-Aldrich | 92822 | |
| 소 혈청 알부민 | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| DiOC6 (3) | Sigma-Aldrich | 318426 | |
| DyLight 650 2차 항체 | Abcam | ab96886 | |
| ERα 1차 항체 | Abcam | ab75635 | |
| ERβ 1차 항체 | Abcam | ab3576 | |
| 에탄올 | Avantor 성능 재료 폴란드 | 396480111 | |
| 포름알데히드 | Avantor 성능 재료 폴란드 | 432173111 | |
| GPER 1차 항체 | Abcam | ab39742 | |
| 염산 | Avantor Performance Materials 폴란드 | 575283421 | |
| 수소 과산화효소 | Avantor Performance Materials 폴란드 | 885193111 | |
| 이소플루란(구멍) | Baxter | 1001936040 | |
| Normal goat serum | Gibco | 16210064 | |
| Paraffin | Leica Biosystems | 39602012 | |
| Petrie dish | Nest Scientific | 705001 | |
| 인산염 완충액 식염수 | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| 생리식염수 | Sigma-Aldrich | 7982 | |
| Primocin (항생제) | Invitrogen | ant-pm-1 | |
| ProLong Diamond Antifage Mountant with DAPI (glycerol-based liquid with DAPI) | Invitrogen | P36971 | |
| 염화나트륨 | Chempur | WE/231-598-3 | |
| 구연산나트륨 | 아반토르 성능 재료 폴란드 | 795780429 | |
| Tris | 아반토르 성능 재료 폴란드 | 853470115 | |
| 트리톤 X-100 | 시그마-알드리치 | T8787 | |
| 트윈 20 | 시그마-알드리치 | P9416 | |
| 크실렌 | 아반토르 성능 재료 폴란드 | BA0860119 |
참고문헌
- Zhang, Y. Z., Li, Y. Y. Inflammatory bowel disease: pathogenesis. World Journal of Gastroenterology. 20 (1), 91-99 (2014).
- Morris, G. P., et al. Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon. Gastroenterology. 96<....
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