Визуализация рецепторов эстрогена в колонах мышей с TNBS-индуцированной болезнью Крона с использованием иммунофлюоресценции
Summary
Протокол представляет собой полную проверенную модель Murine, индуцированную TNBS, болезнь Крона и методы визуализации рецепторов эстрогена иммуногистохимией с использованием иммунофлюоресценции формалино-фиксированных секций толстой кишки, встроенных в парафин.
Abstract
Болезнь Крона является наиболее диагностируется тип воспалительных заболеваний кишечника. Хроническое воспаление, развивающаяся в кишечнике, приводит к нарушению перистальции и повреждению слизистой оболочки кишечника и, кажется, связано с повышенным риском неопластической трансформации толстой кишки. Накопление доказательств указывает на то, что эстрогены и рецепторы эстрогена влияют не только на гормоночувствительные ткани, но и на другие ткани, не имеющие прямого отношения к эстрогенам, таким как легкие или толстой кишки. Здесь мы описываем протокол для успешного иммунофлуоресцентного окрашивания рецепторов эстрогена в толстой кишке, полученного от модели мурина болезни Крона, индуцированной TNBS. Предоставляется подробный протокол для индукции болезни Крона у мышей и подготовки кишечника, а также пошаговая иммуногистохимическая процедура с использованием формалино-фиксированного парафин-встроенных секций кишечника. Описанные методы не только полезны для обнаружения рецепторов эстрогена и эстроген сигнализации исследования in vivo, но также могут быть применены к другим белкам, которые могут быть вовлечены в развитие колита.
Introduction
Болезнь Крона (CD) является воспалительным заболеванием кишечника (IBD) проявляется как хроническое воспаление кишечника. Этиология CD плохо понимается, но есть несколько основных факторов, которые, как представляется, несут ответственность за развитие компакт-диска, в том числе кишечной микробиоты, и генетические и экологические факторы, такие как диета или стресс1. Для лучшего понимания патогенеза болезни Крона, несколько моделей кишечного воспаления были использованы2,,3,,4,,5,,6,7. В этой статье мы представляем результаты, полученные из 2,4,6-тринитробензенсеновой сульфоновой кислоты (TNBS)-индуцированной модели murine CD.
Было документально подтверждено, что эстрогены способны модулировать хроническое воспаление кишечника8,9,10,11,12. Биологическая активность эстрогенов опосредованается cognate рецепторов, среди которых являются ядерные рецепторы эстрогена (ERs), т.е. ЭРЗ (ген ESR1) и Эр-Эра (ген ESR2), а также G13,14белка связанных рецепторов эстрогена, т.е., GPER (ген GPER1), называется Есть несколько методов для определения уровня рецепторов эстрогена, но лишь немногие из них могут быть использованы для визуализации их в кишечнике.
Иммуногистохимия (IHC) является широко используемым методом в клинических и базовых исследованиях для обнаружения определенных антигенов в клетках или тканях с флюорохром-конъюгированными антителами. IHC, как представляется, является важным методом в визуализации структуры тканей, а также в выявлении и локализации конкретных белков, которые могут иметь решающее значение для понимания развития колита. Здесь мы представляем полный и проверенный протокол для иммуногистохимической визуализации рецепторов эстрогена в кишечнике с использованием иммунофлуоресценции.
Protocol
Representative Results
Discussion
Существует множество моделей животных для исследования ПАтофизиологии IBD, включая генетические, иммунологические или спонтанные модели, а также химически индуцированные модели15. Среди нескольких типов животных моделей колита, химически индуцированных моделей, таких как…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа была опубликована благодаря финансовой поддержке властей Лодзинского университета: проректора по научным исследованиям, проректора по национальному и международному сотрудничеству, декана факультета биологии и охраны окружающей среды. Damian Jacenik was supported by grants (2017/24/T/NZ5/00045 and 2015/17/N/NZ5/00336) from National Science Centre, Poland.
Materials
| Animals | |||
| BALB/C mice | University of Lodz | NA | |
| Equipment | |||
| Caliper | VWR | 62379-531 | |
| Cardboard block | NA | NA | |
| Confocal microscope – TCS SP8 | Leica Biosystems | NA | |
| Fully automated rotary microtome – RM2255 | Leica Biosystems | NA | |
| Glass slide | Thermo Scientific | J1800BMNT | |
| Heated Paraffin Embedding Module – EG1150 H | Leica Biosystems | NA | |
| Histological box | Marfour | LN.138747 | |
| Hydrophobic pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Laboratory balance | Radwag | WL-104-0048 | |
| LAS X software | Leica Biosystems | NA | |
| Metal mold | Marfour | CP.5105 | |
| Sterile gauze | NA | NA | |
| Sterile scissor | NA | NA | |
| Sterile tweezer | NA | NA | |
| Tissue processor – TP1020 | Leica Biosystems | NA | |
| Reagents | |||
| 2, 4, 6-trinitrobenzene sulfonic acid | Sigma-Aldrich | 92822 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| DiOC6 (3) | Sigma-Aldrich | 318426 | |
| DyLight 650 secondary antibody | Abcam | ab96886 | |
| ERα primary antibody | Abcam | ab75635 | |
| ERβ primary antibody | Abcam | ab3576 | |
| Ethanol | Avantor Performance Materials Poland | 396480111 | |
| Formaldehyde | Avantor Performance Materials Poland | 432173111 | |
| GPER primary antibody | Abcam | ab39742 | |
| Hydrochloric acid | Avantor Performance Materials Poland | 575283421 | |
| Hydrogen peroxidase | Avantor Performance Materials Poland | 885193111 | |
| isoflurane (forane) | Baxter | 1001936040 | |
| Normal goat serum | Gibco | 16210064 | |
| Paraffin | Leica Biosystems | 39602012 | |
| Petrie dish | Nest Scientific | 705001 | |
| Phosphate buffer saline | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Physiological saline | Sigma-Aldrich | 7982 | |
| Primocin (antibiotic) | Invitrogen | ant-pm-1 | |
| ProLong Diamond Antifage Mountant with DAPI (glycerol-based liquid with DAPI) | Invitrogen | P36971 | |
| Sodium chloride | Chempur | WE/231-598-3 | |
| Sodium citrate | Avantor Performance Materials Poland | 795780429 | |
| Tris | Avantor Performance Materials Poland | 853470115 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Xylene | Avantor Performance Materials Poland | BA0860119 |
References
- Zhang, Y. Z., Li, Y. Y. Inflammatory bowel disease: pathogenesis. World Journal of Gastroenterology. 20 (1), 91-99 (2014).
- Morris, G. P., et al. Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon. Gastroenterology. 96 (3), 795-803 (1989).
- Okayasu, I., et al. A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice. Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).
- Boirivant, M., Fuss, I. J., Chu, A., Strober, W. Oxazolone colitis: a murine model of T helper cell type 2 colitis treatable with antibodies to interleukin 4. Journal of Experimental Medicine. 188 (10), 1929-1939 (1998).
- Morrissey, P. J., Charrier, K., Braddy, S., Liggitt, D., Watson, J. D. CD4+ T cells that express high levels of CD45RB induce wasting disease when transferred into congenic severe combined immunodeficient mice. Disease development is prevented by cotransfer of purified CD4+ T cells. Journal of Experimental Medicine. 178 (1), 237-244 (1993).
- Kühn, R., Löhler, J., Rennick, D., Rajewsky, K., Müller, W. Interleukin-10-deficient mice develop chronic enterocolitis. Cell. 75 (2), 263-274 (1993).
- Sundberg, J. P., Elson, C. O., Bedigian, H., Birkenmeier, E. H. Spontaneous, heritable colitis in a new substrain of C3H/HeJ mice. Gastroenterology. 107 (6), 1726-1735 (1994).
- Harnish, D. C., et al. Beneficial effects of estrogen treatment in the HLA-B27 transgenic rat model of inflammatory bowel disease. American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 286 (1), 118-125 (2004).
- Pierdominici, M., et al. Linking estrogen receptor β expression with inflammatory bowel disease activity. Oncotarget. 6 (38), 40443-40451 (2015).
- Włodarczyk, M., et al. G protein-coupled receptor 30 (GPR30) expression pattern in inflammatory bowel disease patients suggests its key role in the inflammatory process. A preliminary study. Journal of Gastrointestinal and Liver Diseases. 26 (1), 29-35 (2017).
- Mohammad, I., et al. Estrogen receptor α contributes to T cell-mediated autoimmune inflammation by promoting T cell activation and proliferation. Science Signaling. 11 (526), eaap9415 (2018).
- Jacenik, D., et al. G protein-coupled estrogen receptor mediates anti-inflammatory action in Crohn’s disease. Scientific Reports. 9 (1), 6749 (2019).
- Prossnitz, E. R., Barton, M. The G protein-coupled estrogen receptor GPER in health and disease. Nature Review Endocrinology. 7 (12), 715-726 (2011).
- Yaşar, P., Ayaz, G., User, S. D., Güpür, G., Muyan, M. Molecular mechanisms of estrogen-estrogen receptor signaling. Reproductive Medicine and Biology. 16 (1), 4-20 (2016).
- Pizarro, T. T., Arseneau, K. O., Bamias, G., Cominelli, F. Mouse models for the study of Crohn’s disease. Trends in Molecular Medicine. 9 (5), 218-222 (2003).
- Neurath, M. F., Fuss, I., Kelsall, B. L., Stüber, E., Strober, W. Antibodies to interleukin 12 abrogate established experimental colitis in mice. Journal of Experimental Medicine. 182 (5), 1281-1290 (1995).
- Ikeda, M., et al. Simvastatin attenuates trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis, but not oxazalone-induced colitis. Digestive Diseases and Sciences. 53 (7), 1869-1875 (2007).
- Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., Ranganathan, K. Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation. Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).
