Visualizzazione dei recettori degli estrogeni nei coloni dei topi con la malattia di Crohn indotta da TNBS utilizzando l'immunofluorescenza
Summary
Il protocollo presenta un modello murino completo convalidato dalla TNBS della malattia di Crohn e metodi per la visualizzazione dei recettori estrogeni mediante immunosofochimica utilizzando l’immunofluorescenza delle sezioni del colon fissato in formalina incorporate nella paraffina.
Abstract
La malattia di Crohn è il tipo più diagnosticato di malattia infiammatoria intestinale. L’infiammazione cronica in via di sviluppo nell’intestino porta al disturbo della peristalsi e al danno della mucosa intestinale e sembra essere associato ad un aumento del rischio di trasformazione neoplastica del colon. Sempre più prove indicano che gli estrogeni e i recettori degli estrogeni influenzano non solo i tessuti ormone-sensibili, ma anche altri tessuti non direttamente correlati agli estrogeni, come i polmoni o il colon. Qui, descriviamo il protocollo per la colorazione dell’immunofluorescenza di successo dei recettori degli estrogeni nel colon ottenuti da un modello murino della malattia di Crohn indotta da TNBS. Viene fornito un protocollo dettagliato per l’induzione della malattia di Crohn nella preparazione di topi e intestini, nonché una procedura immunohistochimica passo-passo utilizzando sezioni intestinali incorporate con paraffina fissata a formalina. I metodi descritti non sono solo utili per il rilevamento del recettore degli estrogeni e l’indagine di segnalazione degli estrogeni in vivo, ma possono anche essere applicati per altre proteine che possono essere coinvolte nello sviluppo della colite.
Introduction
La malattia di Crohn (CD) è una malattia infiammatoria intestinale (IBD) manifestata come infiammazione cronica intestinale. L’eziologia del CD è poco compresa, ma ci sono alcuni fattori principali che sembrano essere responsabili dello sviluppo del CD, tra cui il microbiota intestinale, e fattori genetici e ambientali, come la dieta o lo stress1. Per una migliore comprensione della patogenesi della malattia di Crohn, sono stati utilizzati diversi modelli di infiammazione intestinale2,3,4,5,6,7.7 In questo articolo, presentiamo risultati ottenuti da un modello di murino indotto da 2,4,6 trinitrobenzene (TNBS) di CD.
È stato documentato che gli estrogeni sono in grado di modulare l’infiammazione intestinale cronica8,9,10,11,12. L’attività biologica degli estrogeni è mediata dai recettori cognati, tra cui i recettori degli estrogeni nucleari (ER), cioè l’ER (gene ESR1)e l’ER (gene ESR2),così come il recettore degli estrogeni accoppiato alle proteine G, vale a dire GPER (gene GPER1), indicato come ER13,14. Ci sono diversi metodi per determinare il livello di recettori degli estrogeni, ma solo pochi possono essere utilizzati per visualizzarli nell’intestino.
L’immunohistochimica (IHC) è un metodo ampiamente utilizzato negli studi clinici e di base per la rilevazione di alcuni antigeni nelle cellule o nei tessuti con anticorpi coniugati fluorocro. IHC sembra essere un metodo importante nella visualizzazione della struttura tissutale, così come nell’identificazione e localizzazione di proteine specifiche, che può essere cruciale per comprendere lo sviluppo della colite. Qui, presentiamo un protocollo completo e convalidato per la visualizzazione immunohistochimica dei recettori degli estrogeni nell’intestino utilizzando l’immunofluorescenza.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ci sono numerosi modelli animali per l’esame di fisiologia IBD, compresi i modelli genetici, immunologici o spontanei, così come i modelli chimicamente indotti15. Tra i diversi tipi di modelli animali di colite, modelli indotti chimicamente come il modello indotto da TNBS descritti in questo protocollo, sono relativamente economici e facili da ottenere. Il modello murino indotto dalla TNBS della colite ha diversi sintomi clinici legati alla base patologica del CD. Gli animali con colite indotta s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il lavoro è stato pubblicato grazie al sostegno finanziario delle autorità dell’Università di Lodz: Vice-Rettore per la Ricerca Scientifica, Vice-Rettore per la Cooperazione Nazionale e Internazionale e Preside della Facoltà di Biologia e Protezione Ambientale. Damian Jacenik è stata sostenuta da sovvenzioni (2017/24/T/N’N’5/00045 e 2015/17/N/N/N’N/00336) del Centro Nazionale di Scienze, Polonia.
Materials
| Animals | |||
| BALB/C mice | University of Lodz | NA | |
| Equipment | |||
| Caliper | VWR | 62379-531 | |
| Cardboard block | NA | NA | |
| Confocal microscope – TCS SP8 | Leica Biosystems | NA | |
| Fully automated rotary microtome – RM2255 | Leica Biosystems | NA | |
| Glass slide | Thermo Scientific | J1800BMNT | |
| Heated Paraffin Embedding Module – EG1150 H | Leica Biosystems | NA | |
| Histological box | Marfour | LN.138747 | |
| Hydrophobic pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Laboratory balance | Radwag | WL-104-0048 | |
| LAS X software | Leica Biosystems | NA | |
| Metal mold | Marfour | CP.5105 | |
| Sterile gauze | NA | NA | |
| Sterile scissor | NA | NA | |
| Sterile tweezer | NA | NA | |
| Tissue processor – TP1020 | Leica Biosystems | NA | |
| Reagents | |||
| 2, 4, 6-trinitrobenzene sulfonic acid | Sigma-Aldrich | 92822 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| DiOC6 (3) | Sigma-Aldrich | 318426 | |
| DyLight 650 secondary antibody | Abcam | ab96886 | |
| ERα primary antibody | Abcam | ab75635 | |
| ERβ primary antibody | Abcam | ab3576 | |
| Ethanol | Avantor Performance Materials Poland | 396480111 | |
| Formaldehyde | Avantor Performance Materials Poland | 432173111 | |
| GPER primary antibody | Abcam | ab39742 | |
| Hydrochloric acid | Avantor Performance Materials Poland | 575283421 | |
| Hydrogen peroxidase | Avantor Performance Materials Poland | 885193111 | |
| isoflurane (forane) | Baxter | 1001936040 | |
| Normal goat serum | Gibco | 16210064 | |
| Paraffin | Leica Biosystems | 39602012 | |
| Petrie dish | Nest Scientific | 705001 | |
| Phosphate buffer saline | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Physiological saline | Sigma-Aldrich | 7982 | |
| Primocin (antibiotic) | Invitrogen | ant-pm-1 | |
| ProLong Diamond Antifage Mountant with DAPI (glycerol-based liquid with DAPI) | Invitrogen | P36971 | |
| Sodium chloride | Chempur | WE/231-598-3 | |
| Sodium citrate | Avantor Performance Materials Poland | 795780429 | |
| Tris | Avantor Performance Materials Poland | 853470115 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Xylene | Avantor Performance Materials Poland | BA0860119 |
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