Visualisering av østrogenreseptorer i kolon av mus med TNBS-indusert Crohns sykdom ved hjelp av immunofluorescens
Summary
Protokollen presenterer en fullstendig validert TNBS-indusert murine modell av Crohns sykdom og metoder for visualisering av østrogenreseptorer ved immunhistokjemi ved hjelp av immunofluorescens av formalin-faste kolon seksjoner innebygd i parafin.
Abstract
Crohns sykdom er den mest diagnostiserte typen inflammatorisk tarmsykdom. Kronisk betennelse i tarmen fører til peristaltikklidelse og skade på tarmslimhinnen og synes å være forbundet med økt risiko for kolonneoplastisk transformasjon. Akkumulerende bevis indikerer at østrogener og østrogenreseptorer påvirker ikke bare hormonfølsomme vev, men også andre vev som ikke er direkte relatert til østrogener, som lungene eller tykktarmen. Her beskriver vi protokollen for vellykket immunfluorescensfarging av østrogenreseptorer i tykktarm hentet fra en murinemodell av TNBS-indusert Crohns sykdom. En detaljert protokoll for induksjon av Crohns sykdom hos mus og tarmforberedelse er gitt, samt en trinnvis immunohistokjemisk prosedyre ved hjelp av formalin-faste parafin-innebygde tarmseksjoner. De beskrevne metodene er ikke bare nyttige for østrogen reseptor deteksjon og østrogen signalering undersøkelse in vivo men kan også brukes på andre proteiner som kan være involvert i utviklingen av kolitt.
Introduction
Crohns sykdom (CD) er en inflammatorisk tarmsykdom (IBD) manifestert som kronisk tarmbetennelse. Etiologien til CD er dårlig forstått, men det er noen viktige faktorer som synes å være ansvarlig for CD-utvikling, inkludert intestinal mikrobiota, og genetiske og miljømessige faktorer, som kosthold eller stress1. For en bedre forståelse av patogenesen av Crohns sykdom, har flere modeller av tarmbetennelse blitt brukt2,3,4,5,6,7. I denne artikkelen presenterer vi resultater hentet fra en 2,4,6-trinitrobenzen sulfonsyre (TNBS)-indusert murine modell av CD.
Det har blitt dokumentert at østrogener er i stand til å modulere kronisk tarmbetennelse8,9,10,11,12. Den biologiske aktiviteten til østrogener formidles av cognate reseptorer, blant annet er kjernefysiskøstrogen reseptorer (ERs),13,14dvs. ESR1 ESR2 GPER1 Det finnes flere metoder for å bestemme nivået av østrogenreseptorer, men bare noen få kan brukes til å visualisere dem i tarmen.
Immunohistochemistry (IHC) er en mye brukt metode i kliniske og grunnleggende studier for påvisning av visse antigener i celler eller vev med fluorokrom-konjugerte antistoffer. IHC synes å være en viktig metode i vevstruktur visualisering, samt i identifisering og lokalisering av spesifikke proteiner, som kan være avgjørende for å forstå utviklingen av kolitt. Her presenterer vi en komplett og validert protokoll for immunohistokjemisk visualisering av østrogenreseptorer i tarmen ved hjelp av immunofluorescens.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det finnes mange dyremodeller for IBD pathofphysiology undersøkelse, inkludert genetiske, immunologiske eller spontane modeller, samt kjemisk indusert modeller15. Blant de flere typer dyremodeller av kolitt er kjemisk induserte modeller som TNBS-indusert modell beskrevet i denne protokollen relativt billig og lett å få tak i. TNBS-indusert murinemodell av kolitt har flere kliniske symptomer relatert til den patologiske grunnlaget for CD. Dyr med indusert kolitt er preget av inkonsekvent avføri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbeidet ble publisert takket være økonomisk støtte fra Universitetet i Lodz myndigheter: Vice-Rektor for vitenskapelig forskning, vice-rektor for nasjonalt og internasjonalt samarbeid og dekanved fakultet for biologi og miljøvern. Damian Jacenik ble støttet av tilskudd (2017/24/T/NZ5/00045 og 2015/17/N/NZ5/00336) fra National Science Centre, Polen.
Materials
| Animals | |||
| BALB/C mice | University of Lodz | NA | |
| Equipment | |||
| Caliper | VWR | 62379-531 | |
| Cardboard block | NA | NA | |
| Confocal microscope – TCS SP8 | Leica Biosystems | NA | |
| Fully automated rotary microtome – RM2255 | Leica Biosystems | NA | |
| Glass slide | Thermo Scientific | J1800BMNT | |
| Heated Paraffin Embedding Module – EG1150 H | Leica Biosystems | NA | |
| Histological box | Marfour | LN.138747 | |
| Hydrophobic pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Laboratory balance | Radwag | WL-104-0048 | |
| LAS X software | Leica Biosystems | NA | |
| Metal mold | Marfour | CP.5105 | |
| Sterile gauze | NA | NA | |
| Sterile scissor | NA | NA | |
| Sterile tweezer | NA | NA | |
| Tissue processor – TP1020 | Leica Biosystems | NA | |
| Reagents | |||
| 2, 4, 6-trinitrobenzene sulfonic acid | Sigma-Aldrich | 92822 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| DiOC6 (3) | Sigma-Aldrich | 318426 | |
| DyLight 650 secondary antibody | Abcam | ab96886 | |
| ERα primary antibody | Abcam | ab75635 | |
| ERβ primary antibody | Abcam | ab3576 | |
| Ethanol | Avantor Performance Materials Poland | 396480111 | |
| Formaldehyde | Avantor Performance Materials Poland | 432173111 | |
| GPER primary antibody | Abcam | ab39742 | |
| Hydrochloric acid | Avantor Performance Materials Poland | 575283421 | |
| Hydrogen peroxidase | Avantor Performance Materials Poland | 885193111 | |
| isoflurane (forane) | Baxter | 1001936040 | |
| Normal goat serum | Gibco | 16210064 | |
| Paraffin | Leica Biosystems | 39602012 | |
| Petrie dish | Nest Scientific | 705001 | |
| Phosphate buffer saline | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Physiological saline | Sigma-Aldrich | 7982 | |
| Primocin (antibiotic) | Invitrogen | ant-pm-1 | |
| ProLong Diamond Antifage Mountant with DAPI (glycerol-based liquid with DAPI) | Invitrogen | P36971 | |
| Sodium chloride | Chempur | WE/231-598-3 | |
| Sodium citrate | Avantor Performance Materials Poland | 795780429 | |
| Tris | Avantor Performance Materials Poland | 853470115 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Xylene | Avantor Performance Materials Poland | BA0860119 |
References
- Zhang, Y. Z., Li, Y. Y. Inflammatory bowel disease: pathogenesis. World Journal of Gastroenterology. 20 (1), 91-99 (2014).
- Morris, G. P., et al. Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon. Gastroenterology. 96 (3), 795-803 (1989).
- Okayasu, I., et al. A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice. Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).
- Boirivant, M., Fuss, I. J., Chu, A., Strober, W. Oxazolone colitis: a murine model of T helper cell type 2 colitis treatable with antibodies to interleukin 4. Journal of Experimental Medicine. 188 (10), 1929-1939 (1998).
- Morrissey, P. J., Charrier, K., Braddy, S., Liggitt, D., Watson, J. D. CD4+ T cells that express high levels of CD45RB induce wasting disease when transferred into congenic severe combined immunodeficient mice. Disease development is prevented by cotransfer of purified CD4+ T cells. Journal of Experimental Medicine. 178 (1), 237-244 (1993).
- Kühn, R., Löhler, J., Rennick, D., Rajewsky, K., Müller, W. Interleukin-10-deficient mice develop chronic enterocolitis. Cell. 75 (2), 263-274 (1993).
- Sundberg, J. P., Elson, C. O., Bedigian, H., Birkenmeier, E. H. Spontaneous, heritable colitis in a new substrain of C3H/HeJ mice. Gastroenterology. 107 (6), 1726-1735 (1994).
- Harnish, D. C., et al. Beneficial effects of estrogen treatment in the HLA-B27 transgenic rat model of inflammatory bowel disease. American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 286 (1), 118-125 (2004).
- Pierdominici, M., et al. Linking estrogen receptor β expression with inflammatory bowel disease activity. Oncotarget. 6 (38), 40443-40451 (2015).
- Włodarczyk, M., et al. G protein-coupled receptor 30 (GPR30) expression pattern in inflammatory bowel disease patients suggests its key role in the inflammatory process. A preliminary study. Journal of Gastrointestinal and Liver Diseases. 26 (1), 29-35 (2017).
- Mohammad, I., et al. Estrogen receptor α contributes to T cell-mediated autoimmune inflammation by promoting T cell activation and proliferation. Science Signaling. 11 (526), eaap9415 (2018).
- Jacenik, D., et al. G protein-coupled estrogen receptor mediates anti-inflammatory action in Crohn’s disease. Scientific Reports. 9 (1), 6749 (2019).
- Prossnitz, E. R., Barton, M. The G protein-coupled estrogen receptor GPER in health and disease. Nature Review Endocrinology. 7 (12), 715-726 (2011).
- Yaşar, P., Ayaz, G., User, S. D., Güpür, G., Muyan, M. Molecular mechanisms of estrogen-estrogen receptor signaling. Reproductive Medicine and Biology. 16 (1), 4-20 (2016).
- Pizarro, T. T., Arseneau, K. O., Bamias, G., Cominelli, F. Mouse models for the study of Crohn’s disease. Trends in Molecular Medicine. 9 (5), 218-222 (2003).
- Neurath, M. F., Fuss, I., Kelsall, B. L., Stüber, E., Strober, W. Antibodies to interleukin 12 abrogate established experimental colitis in mice. Journal of Experimental Medicine. 182 (5), 1281-1290 (1995).
- Ikeda, M., et al. Simvastatin attenuates trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis, but not oxazalone-induced colitis. Digestive Diseases and Sciences. 53 (7), 1869-1875 (2007).
- Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., Ranganathan, K. Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation. Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).
