Summary
Denne protokol beskriver metode, materialer, udstyr og trin til bottom-up forberedelse af RNA og proteinproducerende syntetiske celler. Den indre vandige rum af de syntetiske celler indeholdt S30 bakterielle lysat indkapslet i en lipid tolags (dvs. stabile liposomer), ved hjælp af en vand-i-olie emulsion overførsel metode.
Abstract
Bottom-up-samlingsmetoden til konstruktion af syntetiske celler er et effektivt værktøj til at isolere og undersøge cellulære processer i et celleefterlignende miljø. Desuden har udviklingen af cellefrie ekspressionssystemer vist evnen til at rekonstituere proteinproduktion, transskription og oversættelsesprocesser (DNA→RNA→protein) på en kontrolleret måde, der udnytter syntetisk biologi. Her beskriver vi en protokol til fremstilling af en celle-frit udtryk system, herunder produktion af en potent bakteriel lysat og indkapsle dette lysat inde kolesterol-rige lipid-baserede kæmpe unilamellar vesikler (GUVs) (dvs. stabile liposomer), til at danne syntetiske celler. Protokollen beskriver metoderne til fremstilling af komponenterne i de syntetiske celler, herunder produktion af aktive bakterielysater, efterfulgt af en detaljeret trinvis forberedelse af de syntetiske celler baseret på en vand-i-olie-emulsionsoverførselsmetode. Disse letter produktionen af millioner af syntetiske celler på en enkel og overkommelig måde med en høj alsidighed til at producere forskellige typer af proteiner. De opnåede syntetiske celler kan bruges til at undersøge protein/RNA-produktion og -aktivitet i et isoleret miljø, i styret udvikling, og også som en kontrolleret lægemiddelleveringsplatform til on-demand produktion af terapeutiske proteiner inde i kroppen.
Introduction
Syntetiske celler er kunstige celle-lignende partikler, efterligne en eller flere funktioner i en levende celle, såsom evnen til at opdele, danne membran interaktioner, og syntetisere proteiner baseret på en genetisk kode1,2,3. Syntetiske celler, der omslutter cellefrie proteinsyntesesystemer (CFPS) har høj modularitet på grund af deres evne til at producere forskellige proteiner og RNA-sekvenser efter ændringer i DNA-skabelonen. Cfps-systemer, der udgør et attraktivt alternativ til de nuværende tilgange til proteinproduktion, er baseret på cellelysat, rensede komponenter eller syntetiske komponenter og omfatter alle de transskriptions- og oversættelsesmaskiner, der kræves til proteinsyntese, såsom ribosomer, RNA-polymerase, aminosyrer og energikilder (f.eks. 3-phosphoglycerat og adenintrifosfat)4,5,6,7,8,9. Indkapslingen af et CFPS-system inde i lipidvesikler muliggør enkel og effektiv produktion af proteiner uden at være afhængig af en levende celle10. Desuden, denne platform tillader syntese af peptider, der kan nedbrydes inde i naturlige celler, produktion af proteiner, der er giftige for levende celler, og ændre proteiner med ikke-naturlige aminosyrer11,12. Syntetiske celler er blevet anvendt som model til forskningsformål , der undersøger de minimale cellekomponenter , der er nødvendige for at muliggøre celleliv fra et evolutionært perspektiv1,13. Syntetiske celler er også blevet anvendt til at opbygge og implementere genetiske kredsløb og som modeller for styret evolution14,15,16. Andre undersøgelser har fokuseret på evne til syntetiske celler til at efterligne den biologiske aktivitet af naturlige celler, der sigter mod at erstatte beskadigede naturlige celler, såsom betaceller hos patienter med diabetes17. Desuden illustrerer disse cfps' evne til at producere en række terapeutiske proteiner, at den ser ud til at kunne indarbejdes i klinisk anvendelse18.
Her beskriver vi en bottom-up lab-skala protokol (Figur 1) til produktion af RNA og proteinproducerende syntetiske celler baseret på et CFPS-system indkapslet i en lipidvesikel. Dette viser den potentielle brug af syntetiske celleplatforme som nye lægemiddelfremføringssystemer til onsite-produktion af et terapeutisk proteinlægemiddel in vivo19. Tidligere undersøgelser har undersøgt optimeringen af den fælles fiskeripolitiks reaktion og cellelysatforberedelsesprocesserne4,8,20. Desuden er der anvendt flere teknikker til cellestørrelse liposom præparat, såsom mikrofluidiske og polymer-baserede dråbe stabiliseringsmetoder21,22,23, som også adskiller sig i liposomer 'lipid sammensætning24,25,26. I den præsenterede protokol fremstilles syntetiske celler ved hjælp af en vand-i-olie-emulsionsoverførselsmetode , og indkapslingsprocessen udføres ved lave temperaturer (<4 °C)5,10,24,27,28. Disse milde betingelser har vist sig at være gunstige for at bevare den biofunktionelle integritet af de molekylære maskiner, nemlig ribosomer og proteiner27,29,30. Partiklernes lipidsammensætning består af både kolesterol og 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (POPC). Den første findes i alle pattedyr cellemembraner og er afgørende for stabilitet, stivhed og permeabilitet reduktion af membranen, og sidstnævnte efterligner pattedyr fosfolipid sammensætning11,13. Den cellulære transskription og oversættelse molekylære maskiner udvindes fra BL21 (DE3) Escherichia coli (E. coli) stamme, som omdannes med pAR1219 plasmid overexpressing T7 RNA polymerase at øge CFPS potens og proteinsyntese. Dette system er blevet anvendt til fremstilling af diagnostiske og terapeutiske proteiner med molekylvægt på op til 66 kDa in vitro og in vivo19,31. Følgende protokol giver en enkel og effektiv metode til produktion af det syntetiske cellesystem, som kan behandle en bred vifte af grundlæggende spørgsmål i forbindelse med proteinsyntese i naturen og kan også anvendes til lægemiddellevering applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Illustration af hele produktionsprotokollen for syntetiske celler er vist i figur 1. Ifølge brugerens behov kan proteinekspressionen (afsnit 3.2) og de syntetiske celledannelsesdele (afsnit 4) dele af protokollen også udføres uafhængigt (med visse tilpasninger).
1. Forberedelse af S30-T7 lysate
- Stribeplade E. coli BL21(DE3) bakterier omdannet med T7 RNA polymerase udtrykker pAR1219 plasmid på en LB-agar plade suppleret med 50 μg/ml ampicillin at opnå enkelt kolonier.
- Klargør en startopløsning: Der vaccineres en enkelt koloni i 5 ml LB-medier suppleret med 50 μg/ml ampicillin i en 100 ml Erlenmeyerkolbe og voks natten over ved hjælp af en gulvinkubatorshaker ved 250 rpm og 37 °C. Forbered dubletter.
- Hvert 5 ml starter ind i 500 ml TB-medier, der er ekstrabehandlet med 50 μg/ml ampicillin i en 2 L Erlenmeyerkolbe med røgledeplader, og voks den ved hjælp af en gulvinkubatorshaker ved 250 rpm og 37 °C, indtil den når OD600 på 0,8-1. Monitorer regelmæssigt ved hjælp af et spektrofotometer.
- Der tilsættes 2-3 ml 100 mM lager af IPTG (for at nå 0,4 - 0,6 mM) til induktion af T7 RNA polymerase udtryk og fortsætte med at dyrke kulturen, indtil den når OD600≈4.
- Opløsningen overføres fra hver Erlenmeyerkolbe til to 250 ml steriliserede centrifugerør.
- Der centrifugeres hver ved 7.000 x g i 10 min ved 4 °C. Kassér supernatanten.
BEMÆRK: På dette stadium kan bakteriepellet opbevares ved -20 °C i et par dage, før du går videre til de næste trin. - Resuspendere hver pellet i 250 ml kold (4 °C) S30 lysatbuffer og centrifugereved 7.000 x g i 10 min ved 4 °C.
BEMÆRK: S30 lysatbufferen bruges til at opretholde proteinstabilitet, efter at cellelysis udføres ved hjælp af homogenisatoren i trin 1.9. Fra dette skridt frem skal alle trin til 1.12 gennemføres fortløbende og hurtigt.
BEMÆRK: Før du fortsætter til næste trin, skal du afkøle spidserne og de 1,5-milliliterhætteglas, der skal bruges til opbevaring af lysatet - Supernatanten kasseres, og re-suspendere alle pellets sammen i 15 ml kold S30 lysate buffer. Filtrer suspensionen med gazepad.
BEMÆRK: 15 ml opløsning skyldes homogenisatormin. Bør bemærkes, at bakterier koncentration er også vigtigt. - Homogeniserved et arbejdstryk på 15.000 psi, med et lufttryk på 4 bar (to gennemløb) for cellebrud. Undgå opløsningsfortynding for en mere koncentreret og aktiv lysat.
- Der tilsættes 100 μL på 0,1 M DTT (FORSIGTIG) pr. 10 ml af den homogeniserede suspension.
- Suspensionen centrifugeres ved 24.700 x g i 30 min ved 4 °C.
- Udfør hurtigt følgende trin for at bevare lysataktiviteten: Del supernatanten en efter en i 200 μL aliquots i forkølede 1,5 ml hætteglas og fastgør dem straks med flydende nitrogen. Opbevares ved -80 °C til videre brug.
FORSIGTIG: DTT klassificeres som irriterende og skadeligt og bør derfor behandles med forsigtighed.
2. Fremstilling af lipider i olieopløsning
- Popc og kolesterol opløses i chloroform (FORSIGTIG) hver til en endelig koncentration på 100 mg/ml. Vortex hvert hætteglas separat.
- Komponenterne sammenlægges i et 2 ml glasglas: Der tilsættes 50 μL POPC i chloroform, 50 μL kolesterol i chloroform og 500 μL mineralsk olie. For 100 μL syntetiske celler kræves der 2 hætteglas lipider i olie.
- Vortex, og derefter varme i ca 1 time ved 80 °C i en kemisk hætte til at fordampe chloroform. Sørg for, at der er sket fuldstændig fordampning ved at følge den angivne tid/betingelser og overvåge opløsningsvolumenet.
BEMÆRK: Den resulterende lipid-i-olie-opløsning kan opbevares ved stuetemperatur i op til to uger. For bedre resultater anbefales det at bruge en frisk forberedelse før hvert eksperiment. Lipid og kolesterol nøgletal kan ændres i henhold til den ønskede membran sammensætning. En høj koncentration af kolesterol kan føre til dannelsen af aggregater i den endelige syntetiske celleopløsning.
FORSIGTIG: Chloroform klassificeres som irriterende og skadelig tandbehandling og bør derfor behandles med forsigtighed og i områder med røgudsugning.
3. Præparater af ydre, præindrede og indfødningsopløsninger
- Udarbejdelse af lagerløsninger
- Klargør de stamopløsninger, der er anført i tabel 2, ved hjælp af ultrarent vand (UPW).
BEMÆRK: Stamopløsninger skal tilberedes på forhånd og opbevares ved -20 °C, indtil det sker yderligere. Reagens 7 tendens til at danne aggregater. Opvarmning til 37 °C vil reducere sammenlægningen. Mindre sammenlægning vil ikke påvirke reaktionen væsentligt. Reagens 8 opløsning er mælkeagtig og uklar.
- Klargør de stamopløsninger, der er anført i tabel 2, ved hjælp af ultrarent vand (UPW).
- Ydre løsning
- Opløs glukose i DNase/RNase-fri H2O til en endelig koncentration på 200 mM.
- Ved 100 μL indvendig opløsning fremstilles 1,6 ml ydre opløsning.
- Præindre løsning
- Reagenser tilsættes 1-14 i overensstemmelse med de mængder og den koncentration, der er anført i tabel 2. For et endeligt syntetisk cellevolumen på 100 μL fremstilles 100 μL indre opløsning f.eks.
BEMÆRK: UPW skal tilføjes for at fuldføre den endelige nødvendige volumen. På dette stadium kan blandingen opbevares ved 4 °C i et par timer.
- Reagenser tilsættes 1-14 i overensstemmelse med de mængder og den koncentration, der er anført i tabel 2. For et endeligt syntetisk cellevolumen på 100 μL fremstilles 100 μL indre opløsning f.eks.
- Fodringsopløsning
- Alle reagenser tilsættes i overensstemmelse med de mængder og den koncentration, der er anført i tabel 3.
BEMÆRK: Brug 1:1 forholdet mellem fremføringsopløsning:indre opløsning. For et endeligt syntetisk cellevolumen på 100 μL fremstilles 100 μL fodringsopløsning. Det anbefales at fremstille en lille overskydende mængde ydre, indre og fodringsopløsning.
- Alle reagenser tilsættes i overensstemmelse med de mængder og den koncentration, der er anført i tabel 3.
4. Fremstilling af syntetiske celler
BEMÆRK: Følgende volumener justeres til fremstilling af 100 μL syntetiske celler.
- Syntetiske celler, der producerer protein
- I et 15 ml rør anbringes 12 ml af den ydre opløsning, og der tilføjes langsomt 500 μL lipider i olieopløsningen oven på et lag. Inkuber ved stuetemperatur i 20 min.
- For at færdiggøre det indre opløsningspræparat: Ingredienserne i den indre opløsning på knust is blandes til et endeligt rumfang på 100 μL ved optøning og tilsætning af S30-T7 Lysate (reagens 15) og DNA plasmid (reagens 16) med den lagrede blanding.
- Til det andet 2 ml glasglas med 500 μL lipider i olieopløsning tilsættes 100 μL af den indre opløsning. Pipette op og ned kraftigt i 1 minut og vortex i endnu et minut på niveau fem.
- Inkuber i 10 minutter på knust is og tilsæt langsomt den resulterende emulsion oven på oliefasen i 15 ml røret (fra 4.1.1).
- Der centrifugeres i 10 min ved 100 x g og 4 °C, og centrifugeres derefter i 10 min ved 400 x g og 4 °C. Ved afslutningen af centrifugering, en pellet i bunden af røret skal overholdes.
BEMÆRK: Brug af en svingende spand centrifuge rotor foretrækkes her for at erhverve en bedre dækning af et andet lag af lipider under vand-i-olie dråber 'passage gennem interfasen. Hvis der ikke er nogen observerbar pellet, kan centrifugeringshastigheden øges til 1000 x g. Ellers skal du se afsnittet Diskussion om den ydre løsnings vægtalvor. - Træk pelleten ud.
- Fjern overskydende olielag.
- Brug en trimmet pipettespids, der er fyldt med ca. 400 μL ydre opløsning til at udtrække pelleten. Slip den ydre opløsning, mens den passerer gennem oliefasen, for kun at samle pelletiden i den vandige fase.
- Tør spidsen af efter udtrækning af pellet for at undgå at overføre olierester og overføre pellet til en ren 1,5 ml rør.
- Der centrifugeres i 10 min ved 1.000 x g og 4 °C, supernatanten fjernes, og pelleten suspenderes igen i 100 μL tilførselsopløsning (1:1 forholdet mellem inder-:e-indføringsopløsninger).
BEMÆRK: Der kan også anvendes en fast vinkelcentrifugerotor her. - For proteinekspression inkuberes i 2 timer ved 37 °C uden at ryste.
BEMÆRK: Den optimale inkubationstid varierer mellem forskellige proteiner. - Vurder den producerede proteinmængde ved hjælp af en passende metode i henhold til målproteinegenskaberne.
- Anbefalede kontrolgrupper
- Indvendig opløsning og bekræftelse af lysataktivitet
- Der fremstilles en komplet indre opløsning (med DNA & S30-T7 lysate).
- Straks inkubere reaktionen ovenfor ved hjælp af en gulvinkubator shaker ved 250 rpm eller en thermomixer ved 1200 rpm, ved en konstant temperatur på 37 °C i 2 timer.
BEMÆRK: Juster inkubationstiden, så den passer til inkubationstiden for syntetiske celler.
- Syntetiske celler
- Negativ kontrolgruppe: Forbered den protokol, der er præsenteret i punkt 4.1, med indre opløsning uden DNA.
- Positiv kontrol: Forbered protokollen præsenteret i 4.1 med indre opløsning, der indeholder en T7 plasmid kodning for en reporter gen.
BEMÆRK: Tilføj en positiv kontrolgruppe bestående af et reporter-gen, såsom sfGFP, sammen med testgrupperne for at sikre indkapslingseffektiviteten.
- Indvendig opløsning og bekræftelse af lysataktivitet
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi præsenterer en protokol til fremstilling af syntetiske celler ved at indkapsle et S30-T7 CFPS-system baseret på BL21 E. coli inde i lipidvesikler. En skematisk beskrivelse af forberedelsesprocessen , der indeholder et billede af hvert trin, præsenteres i figur 2. Succesen af den syntetiske celleforberedelsesproces afhænger af, om hvert trin fungerer korrekt, og at de udføres af forskellige parametre. Protokollen bør tilpasses, så den tager højde for produktionen af et bestemt protein.
Plasmider, der udtrykker modelproteinsupermappen Green Fluorescent Protein (sfGFP) og Renilla Luciferase under T7-promotor, blev indført i CFPS bulkreaktioner og syntetiske celler, og proteinproduktionen blev evalueret ved hjælp af forskellige metoder, herunder western blot, flowcytometri, mikroskopi og spektroskopi (figur 3). En kontrol af sfGFP-Hans6 tagged protein (~ 27 kDa32) produktion ved western blot analyse er præsenteret i figur 3A. En prøve på 30 μL syntetiske celler fortyndet 6 gange blev blandet med 10 μL af en almindelig SDS-PAGE prøvebuffer (indeholdende vaske- og rengøringsmidler natriumdodecylsulfat (SDS) og β-mercaptoethanol) og kogt i 10 minutter (95 oC). Vi konstaterede, at kombinationen af varme og rengøringsmidler i prøvebufferen er tilstrækkelig til at adskille vesiklerne og muliggøre drift af proteiner i SDS-PAGE-gelen. Proteindetektion blev udført ved hjælp af anti-Hans polyklonale primære antistof (fortyndet 1:12,000). Mens proteinproduktion påvises i prøver, der indeholder sfGFP-kodende DNA-skabeloner ("+sfGFP DNA"), observeres der som forventet intet protein i negative kontrolprøver, hvor DNA-skabelonen blev udelukket ("-DNA"). Prøver af renset sfGFP og renset sfGFP indkapslet i syntetiske cellers membran ('sfGFP (indkapslet)), anvendes som positive kontroller for sfGFP CFPS bulkproduktion og til syntese inden for syntetiske celler, respectivley. Denne metode kan anvendes på forskellige proteintyper. Ifølge Krinsky et al.19er det sfGFP-produktionsudbytte, der opnås i henhold til den detaljerede protokol, 380 μg/ml i CFPS-opløsning og 5,3 μg/ml, når CFPS-løsningen indkapsles i lipidvesikler.
Når det protein, der produceres inde i de syntetiske celler er fluorescerende, kan dets produktion evalueres ved hjælp af mikroskopi og flow cytometri-baserede metoder. Vi analyserede de syntetiske celler ved hjælp af et fluorescerende mikroskop med et filter for GFP fluorescens (Figur 3B). Da komponenterne i den fælles fiskeripolitik har en vis autofluorescerende, bør parametrene for billedanskaffelse tilpasses efter en passende negativ kontrolprøve (f.eks. syntetiske celler uden DNA-skabelon).
Derudover brugte vi flowcytometri til at bestemme den gennemsnitlige fluorescensintensitet for sfGFP-producerende syntetiske celler og procentdelen af aktive syntetiske celler, som kan producere proteiner i dem (Figur 3C I&II). Der blev indsamlet 10.000 hændelser for hver analyseret prøve. Den syntetiske celleproduktion, som er beskrevet i denne protokol, giver normalt en aktiv population på 21-25% i en opløsning med en omtrentlig koncentration på 107 syntetiske celler/ml. Den lille fluorescensintensitet, som "DNA"-prøver frembyder i figur 3C II, skyldes autofluorescensen af forskellige komponenter i cfps-reaktionen, såsom S30-lysatet.
Repræsentativ størrelsesanalyse baseret på GFP-signalet (i diameter) af syntetiske celler, der er fremstillet ved den ovenfor beskrevne metode, viser en gennemsnitsværdi på 2,4±0,5 μm (figur 3D II). Da dannelsen af vand i olieemulsion i denne metode er et resultat af at anvende mekaniske kræfter, kan partiklernes størrelsesfordeling blive påvirket af forskellige faktorer, såsom metoden og hastigheden af at pipettere emulsionen op og ned, modellen af vortex-mixermaskinen osv.
For at teste alsidigheden af syntetiske cellers proteinproduktion blev ekspressionen af reporterproteinet Renilla luciferase inde i syntetiske celler analyseret (figur 3E). Analysen kvantificerede Renilla luciferaseaktivitet ved at måle den luminescens, der frembringes af luciferase's enzymatiske reaktion og dets substrat, h-coelenterazin. For at fremkalde enzymatisk reaktion blev der tilsat en endelig koncentration på 1 μM h-coelenterazin til de syntetiske celler (25 μL prøvevolumen) lige før målingen. "DNA"-prøven, der ikke indeholdt dna-skabelonen til luciferase-kodning, blev anvendt som negativ kontrol til test af luminescens på grund af ikke-enzymatisk oxidation af substratet. Luminescens blev målt ved hjælp af en pladelæser.
Figur 1: En illustration af processen for typiske protokoller for fremstilling af syntetiske celler. Processen er opdelt i to trin. Trin 1: Præ-eksperiment præparater, herunder DNA plasmid rensning, S30-T7 lysatpræparat, stamopløsninger forberedelse kræves til den indre og fodring løsninger, lipider-i-olie opløsning forberedelse og ydre opløsning forberedelse. Trin 2: Syntetisk celledannelse, der omfatter fodring og indre opløsninger forberedelse, syntetiske celler forberedelse og analyse. Et eksempel på den nødvendige mængde af hver ingrediens til fremstilling af 100 μL syntetiske celler opløsning præsenteres i blå i parentes. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Skematisk illustration af protokollen til fremstilling af syntetiske celler. Et billede af en veludført proces illustrerer hvert trin i protokollen. Dette tal er blevet ændret fra Krinsky et al.19. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Repræsentative resultater af produktionen af sfGFP og Renilla luciferase inde i syntetiske celler. (A) En vestlig blot analyse af sfGFP-His6 produktion i både CFPS bulk reaktioner og inde i syntetiske celler. Proteindetektion blev udført ved hjælp af anti-Hans polyklonale primære antistof (fortyndet 1:12,000). Renset sfGFP-His6 blev anvendt som positiv kontrol (7,8 μg). sfGFP (indkapslet) er positiv kontrol af renset sfGFP indkapslet i syntetiske celler. Prøver uden DNA-skabeloner blev anvendt som en negativ kontrol for produktionsanalysen ("-DNA"). (B) Repræsentative billeder af sfGFP, der producerer syntetiske celler taget ved hjælp af et fluorescerende mikroskop med et lyst felt og et GFP-filter. Skalastænger = 50 μm. (C) I&II Flow cytometrianalyse af sfGFP-producerende aktivitet for syntetiske celler (Data indsamlet ved hjælp af digital, 4-laseranalysator). Prøverne blev målt efter 3 timers inkubation. Der blev indsamlet 10.000 hændelser for hver analyseret prøve. FSC-filtre (500 V) og SSC (300 V) blev anvendt til at definere den samlede syntetiske cellepopulation. Derefter blev der anvendt et FITC-filter (600 V) til at detektere GFP fluorescens. (I) Beregningen af den aktive syntetiske cellepopulation [%] var baseret på gfp-fluorescensintensitetstærsklen, defineret ved "DNA"-prøven (rødt histogram), hvilket gjorde det muligt at fejle ~1 %. (II) Gennemsnitlig fluorescensintensitet for sfGFP,der producerer syntetiske celler. Denne værdi blev beregnet ud fra den aktive syntetiske cellepopulation og normaliseret til "DNA"-prøven ved at dividere den gennemsnitlige fluorescens af de aktive syntetiske celler med gennemsnitaf de syntetiske celler uden sfGFP-DNA. (D) I&II Analyse af syntetisk cellestørrelse. Emissionsspektret blev detekteret med henholdsvis 505-560 nm og 642-745 nm for GFP og lyse feltsignaler. (I) Et repræsentativt billede af de analyserede syntetiske celler. (II) Syntetiske cellers størrelsesfordeling. Analysen blev udført, og diameterfordelingen af de aktive syntetiske celler blev beregnet på grundlag af GFP-signalet. (E) Produktion af aktive Renilla luciferase inde i syntetiske celler. Luciferase-aktiviteten blev kvantificeret med luminescensmålinger efter tilsætning af 1 μM h-coelenterazin ved hjælp af en pladelæser og præsenteret som lysintensitet [RLU] x 106. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Tabel 1: Forberedelse af stødpude- og svarløsninger. | |
| Kommentarer | |
| Luria Bertani (LB) agar (1.5%) Plade: | Forbered og steriliser. Ampicillin tilsættes kun ved en endelig koncentration på 50 μg/ml efter afkøling til stuetemperatur. |
| 10 g/L Bacto-tryptone | |
| 10 g/L Natriumchlorid (NaCl) | |
| 5 g/L Bacto-Gær ekstrakt | |
| 15 g/L Agar agar renset | |
| 50 μg/ml Ampicillin | |
| LB-medier (20 ml): | Minimal medier. Forbered og steriliser på forhånd. Lige før bakterierne podes, tilsættes Ampicillin ved en endelig koncentration på 50 μg/ml. |
| 10 g/L Bacto-tryptone | |
| 10 g/L Natriumchlorid (NaCl) | |
| 5 g/L Bacto-Gær ekstrakt | |
| 50 μg/ml Ampicillin | |
| Fantastisk Bouillon (TB) medier (1 L): | Rige medier. Forbered og steriliser på forhånd. Lige før bakterierne podes, tilsættes Ampicillin ved en endelig koncentration på 50 μg/ml. |
| 12 g/L Bacto-tryptone | |
| 24 g/L Bacto-Gær ekstrakt | |
| 4% (v/v) Glycerol vandfri | |
| 2.32 g/L K2HPO4 | |
| 12,54 g/L KH2PO4 | |
| 50 μg/ml Ampicillin | |
| S30 lysate buffer (1,5 L): | Klargør og steriliseres på forhånd (*undtagen DTT og 2-mercaptoethanol). Opbevares ved -4 °C. |
| 10 mM Tris-acetat ved pH = 7,4 | Trisma-base. Klargør og juster pH til 7.4 med eddikesyre. |
| 14 mM magnesium acetat | |
| 60 mM kaliumacetat | |
| *1 mM DTT | Tilføj lige før brug |
| *0,5 ml/L 2-mercaptoethanol | Tilføj lige før brug |
| 1 M HEPES-KOH (pH = 8): | HEPES opløses i en endelig koncentration på 1 M. Juster til pH 8 ved hjælp af KOH-opløsning. |
| HEPES (HEPES) | |
| Kaliumhydroxid (KOH) | |
| Tabel 2: Indre opløsningssammensætning. | ||||||||||
| Endelig anmodet indre løsningsdiskenhed | ||||||||||
| Antallet | Reagens | Stock conc. | Endelig conc. | 25 μL | 50 μL | 100 μL | 200 μL | 300 μL | 400 μ L | |
| 1 | HEPES KOH pH=8 | 1 m | 55 mM | 1.375 | 2.75 | 5.5 | 11 | 16.5 | 22 | Præ-indre løsning |
| 2 | Magnesium acetat | 1 m | 14 mM | 0.35 | 0.7 | 1.4 | 2.8 | 4.2 | 5.6 | |
| 3 | Kaliumacetat | 1 m | 50 mM | 1.25 | 2.5 | 5 | 10 | 15 | 20 | |
| 4 | Ammoniumacetat | 5,2 m | 155 mM | 0.75 | 1.5 | 3 | 6 | 9 | 12 | |
| 5 | PEG 6000 | 50% | 3% | 1.5 | 3 | 6 | 12 | 18 | 24 | |
| 6 | 3 PGA | 0,5 M | 40 mM | 2 | 4 | 8 | 16 | 24 | 32 | |
| 7 | Aminosyrer - blanding I | 50 m | 2,5 mM | 1.25 | 2.5 | 5 | 10 | 15 | 20 | |
| 8 | Aminosyrer - blanding II | 50 m | 2,5 mM | 1.25 | 2.5 | 5 | 10 | 15 | 20 | |
| 9 | Atp | 100 mM | 1,2 mM | 0.3 | 0.6 | 1.2 | 2.4 | 3.6 | 4.8 | |
| 10 | GTP | 50 mM | 1 mM | 0.5 | 1 | 2 | 4 | 6 | 8 | |
| 11 | Utp | 100 mM | 0,8 mM | 0.2 | 0.4 | 0.8 | 1.6 | 2.4 | 3.2 | |
| 12 | IPTG (IPTG) | 100 mM | 1 mM | 0.25 | 0.5 | 1 | 2 | 3 | 4 | |
| 13 | Saccharose | 2 M | 200 mM | 2.5 | 5 | 10 | 20 | 30 | 40 | |
| 14 ** | H2O UPW | ** | ** | ** | ** | ** | ** | |||
| 15 | S30-T7 Lysate | 34% | 8.5 | 17 | 34 | 68 | 102 | 136 | ||
| 16 * | DNA plasmid | 10 μg/ml | * | * | * | * | * | * | ||
| Tabel 3: Sammensætning af fodringsopløsning. | |||||||||
| Endelig volumen af anmodet fodringsopløsning | |||||||||
| Antallet | Reagens | aktiekonikke. | endelige conc. | 25 μL | 50 μL | 100 μL | 200 μL | 300 μL | 400 μL |
| 1 | HEPES KOH pH=8 | 1 m | 83,3 mM | 2.08 | 4.17 | 8.33 | 16.67 | 25 | 33.33 |
| 2 | Magnesium acetat | 1 m | 21,2 mM | 0.53 | 1.06 | 2.12 | 4.24 | 6.36 | 8.48 |
| 3 | Kaliumacetat | 1 m | 75,5 mM | 1.89 | 3.78 | 7.55 | 15.1 | 22.66 | 30.2 |
| 4 | Ammoniumacetat | 5,2 m | 236,4 mM | 1.14 | 2.27 | 4.55 | 9.09 | 13.64 | 18.18 |
| 5 | PEG - 6000 | 50% | 4.54% | 2.27 | 4.54 | 9.08 | 18.16 | 27.24 | 36.32 |
| 6 | 3 PGA | 0,5 M | 60,1 mM | 3 | 6.01 | 12.01 | 24.02 | 36.04 | 48.04 |
| 7 | Aminosyrer - blanding I | 50 mM | 3,8 mM | 1.89 | 3.78 | 7.56 | 15.12 | 22.68 | 30.24 |
| 8 | Aminosyrer - blanding II | 50 mM | 3,8 mM | 1.89 | 3.78 | 7.56 | 15.12 | 22.68 | 30.24 |
| 9 | Atp | 100 mM | 1,8 mM | 0.45 | 0.91 | 1.81 | 3.62 | 5.43 | 7.24 |
| 10 | GTP | 50 mM | 1,5 mM | 0.76 | 1.51 | 3.02 | 6.04 | 9.06 | 12.08 |
| 11 | Utp | 100 mM | 1,2 mM | 0.3 | 0.61 | 1.21 | 2.42 | 3.63 | 4.84 |
| 12 | IPTG (IPTG) | 100 mM | 1,5 mM | 0.38 | 0.76 | 1.51 | 3.02 | 4.53 | 6.04 |
| 13 | Glukose | 2 M | 200 mM | 2.5 | 5 | 10 | 20 | 30 | 40 |
| 14 | H2O UPW | 5.92 | 11.83 | 23.7 | 47.38 | 71.06 | 94.76 | ||
| Tabel 4: Nødvendige opløsninger til forberedelse af syntetiske celler. | |
| Der kræves løsninger og materialer | Kommentarer |
| Lipider i olie | Opbevares ved stuetemperatur indtil brug. Udarbejdet i henhold til afsnit 2 |
| Ydre løsning | Udarbejdet i henhold til afsnit 3.1 |
| Indvendig opløsning | Udarbejdet i henhold til punkt 3.2. |
| Prøverne forberedes + kontrolprøver i henhold til punkt 4.1. | |
| Hold på knust is indtil brug. | |
| Fodringsopløsning | Fremstillet i henhold til punkt 3.3. |
| Hold på knust is indtil brug. | |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol indfører en enkel og økonomisk overkommelig metode til produktion af store mængder proteinproducerende syntetiske celler. Udbyttet af aktive celler er afhængig af omhyggelig og præcis udførelse af protokollen med vægt på flere kritiske trin. I lysatpræparatdelen af denne metode er det vigtigt at nå den relevante bakterietæthed før cellelysis for at opnå en tilstrækkelig mængde proteiner i bakterielysatet. For det andet bør lysisprocessen udføres ved 4 °C, og lysatet nedfryses hurtigt med flydende nitrogen for at opretholde proteinaktiviteten. Desuden brugte vi i denne protokol E. coli BL21(DE3) celler omdannet med pAR1219 plasmid, der udtrykker T7 RNA polymerase. I tilfælde, hvor der anvendes en anden bakteriestamme, kan det være nødvendigt at ændre lysatkoncentrationen for at nå en tilfredsstillende mængde RNA-polymerase og ribosomer. Selv når den samme bakterielle stamme anvendes, forskellige lysate produktioner kan have nogle batch-til-batch variabilitet.
Vesikel produktion sektion indeholder også et par væsentlige skridt. Opløselighed af lipider og fjernelse af chloroform fra mineralolien er vigtig for at etablere vand-i-olie emulsion. Centrifugering af vand-i-olie dråber i den ydre vandige buffer er også et vigtigt skridt i protokollen til at generere syntetiske celler med en lipid tolags. Ændringer i vesiklernes indre opløsning og lipidsammensætningen kan føre til et lag dråber ved olie-vand-indfaset uden nogen observerbar pellet. For at overvinde dette, en hurtig løsning er at øge centrifugering hastighed til 1.000 x g i emulsion en overførsel trin. Hvis dette ikke løser problemet, kan den ydre vandige løsnings vægtfylde ændres, så den indre løsning får en højere vægtfylde end den ydre løsning. Desuden kan osmolaliteten af den indre opløsning også variere mellem forskellige lysatkilder og produktioner, der spænder mellem 800-1100 mOsm/kg. Variabilitet i den indre opløsnings osmolalitet skyldes hovedsagelig skiftende koncentrationer af lysatet under produktionsprocessen. Normalt fører dette ikke til væsentlige ændringer i proteinproduktionen, men en stor fortynding kan føre til et reduceret udbytte på grund af lave koncentrationer af transskriptions- og oversættelsesenzymerne i selve lysatet. Måling af den samlede proteinkoncentration i hvert lysatparti kan hjælpe med at indstille lysatkoncentrationerne i den indre opløsning for at opretholde konstante værdier (ca. 22 mg/ml målt ved Bradford-analyse).
Ikke desto mindre har denne metode nogle begrænsninger, der bør nævnes. Ikke alle de genererede syntetiske celler er aktive og i stand til at producere proteiner på grund af ufuldstændig indkapsling af alle de nødvendige komponenter. Vi målte ca. 21-25% af de aktive celler, når vi producerede sfGFP, der udtrykker syntetiske celler ved hjælp af flowcytometri (der blev ikke observeret signifikante størrelsesforskelle mellem aktive og inaktive celler). Olie og lipid overskydende rester lejlighedsvis forbliver i tolags lipid membran efter overførsel af de syntetiske celler i den vandige fase. Optimering af lipid og kolesterol koncentrationer i oliefasen kan forbedre dette problem. Det er også vigtigt at bemærke, at størrelsesfordelingen af de opnåede syntetiske celler er ret bred i forhold til alternative mikrofluidiske metoder med vesikler fra ca. 1-50 μm.
Det høje udbytte af emulsionsoverførselsmetoden gør den specielt velegnet til syntetiske celler, der indkapsler cellefrie proteinsyntesesystemer til terapeutisk proteinproduktion. Der er anvendt forskellige variationer af emulsionsoverførselsmetoden i undersøgelser af syntetiske celler, som omfattede ændringer i olieforberedelsesproceduren, membransammensætningen, prøvevolumen, indre opløsning til olieforhold og centrifugeringshastigheder5,24,28. Mikrofluidiske og polymerbaserede dråbestabiliseringsmetoder er også blevet anvendt til fremstilling af syntetiske celler, men der er endnu ikke udført indkapsling af hele CFPS-systemet med disse metoder21,22,23.
De syntetiske celler, der blev fremstillet ved denne metode, blev vist in vivo til at producere proteiner og behandle kræft i murinemodellerne19. Disse cellers egenskaber kan udvides yderligere i fremtiden ud over proteinekspression. Integration af andre cellulære processer såsom cellulær kommunikation, cytoskelet modifikation og celledeling i syntetiske celler er for nylig blevet beskrevet33,34,35,36. Substitution af bakterielysat med eukaryote celle lysat vil tillade ekspression af proteiner med højere kompleksitet og post-translationelle ændringer, og vil måske være mindre immunogen selv uden en rengøringsprocedure, derfor åbne mere terapeutiske grænser37.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af ERC-STG-2015-680242.
Forfatterne anerkender også støtte fra Technion Integrated Cancer Center (TICC); Russell Berrie Nanotechnology Institute; Lorry I. Lokey Tværfagligt Center for Biovidenskab og Teknik; det israelske økonomiministerium for et Kamin Grant (52752); Det Israelske Ministerium for Videnskabsteknologi og Rum – Chefforskerens Kontor (3-11878); Israel Science Foundation (1778/13, 1421/17); Israel Cancer Association (2015-0116); den tysk-israelske fond for videnskabelig forskning og udvikling af et GIF-tilskud (I-2328-1139.10/2012); Den Europæiske Unions FP-7 IRG-program for et karriereintegrationsstipendium (908049) Phospholipid Forskningscenter Grant; en Rosenblatt Foundation for kræftforskning, en Mallat Family Foundation Grant; og Unger Family Foundation. A. Schroeder anerkender Alon og Taub Stipendier. O. Adir anerkender Sherman og Gutwirth stipendier. G. Chen anerkender Sherman Fellowship. N. Krinsky anerkender baronesse Ariane de Rothschild Kvinder Ph.d.-program fra Rothschild Caesarea Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A. Reagents required for step 1 (S30-T7 lysate preparation) | |||
| E.coli BL21 (DE3) | NEB | C2527 | E.coli BL21 (DE3). |
| pAR1219 | Sigma | T2076 | TargeTron vector for transformation. |
| Stock solution of 50 mg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | Stored at -20 °C. |
| 10 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Luria Bertani (LB) agar (1.5%) plate. |
| 10 g/L Sodium chloride (NaCl) | Bio-Lab | 19030591 | |
| 5 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| 15 g/L Agar agar purified | Merck | 1.01614.5007 | |
| 50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| 10 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Luria Bertani (LB) media (20 mL). |
| 10 g/L Sodium chloride (NaCl) | Bio-Lab | 19030591 | |
| 5 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| 50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| 12 g/L Bacto-tryptone | BD Bioscience | 211705 | For preparation of Terrific Broth (TB) media (1 L). |
| 24 g/L Bacto-Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| 4% (v/v) Glycerol anhydrous | Bio-Lab | 7120501 | |
| 2.32 g/L K2HPO4 | Spectrum chemical | P1383 | |
| 12.54 g/L KH2PO4 | Spectrum chemical | P1380 | |
| 50 µg/mL Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| Stock solution of 100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | INALCO | INA-1758-1400 | Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter. |
| Stock solution of 0.1 M dithiothreitol (DTT) | TCI | D1071 | Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter. |
| 10 mM Tris-acetate at pH = 7.4 | Sigma | T1503 | S30 lysate buffer (1.5 L) |
| 14 mM magnesium acetate | Merck | 1.05819.0250 | |
| 60 mM potassium acetate | Carlo Erba | 470147 | |
| 1 mM DTT | TCI | D1071 | |
| 0.5 mL/L 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| Equipment required for step 1 | |||
| 100 mL sterilized Erlenmeyer flasks | Thermo Scientific | 50-154-2846 | 2 flasks |
| 2 L sterilized Erlenmeyer flasks with baffles | KIMAX-KIMBLE | 25630 | 2 flasks |
| Floor incubator shaker | MRC | TOU-120-2 | Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75004270 | (75003340) - Fiberlite F10-6 x 100 LEX Fixed-Angle Rotor. Should enable at least 13,000 x g. * Pre-cooled to 4 °C. |
| High pressure homogenizer | AVESTIN | EmulsiFlex-C3 | Pre-cooled to 4 °C. |
| -80oC freezer | SO-LOW | U85-18 | |
| Sterilized 1.5 mL plastic tubes | Eppendorf | 30120086 | Preferably pre-cooled to -20 °C. |
| Spectrophotometer | TECAN | IN-MNANO | Infinite M200 pro |
| 96-well transparent plate | Thermo Scientific | 167008 | |
| Sterilized graduated cylinder | Corning | ||
| Sterilized centrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | Preferably pre-cooled to -20 °C. |
| Sterilized pipette tips | Corning | Preferably pre-cooled to -20 °C. | |
| Crushed ice bucket | Bel-Art | M18848-4001 | |
| Small liquid nitrogen tank | NALGENE | 4150-4000 | |
| B. Reagents required for step 3 (lipids in oil solution preparation): | |||
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Lipoid | 556400 | Powder |
| Cholesterol | Sigma | C8667 | Powder |
| Chloroform | Bio-Lab | 3082301 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904 | Light oil |
| Equipment required for step 2 | |||
| Vortex mixer | Scientific industries | SI-0256 | |
| Heating block | TECHNE | FDB03AD | Pre-heated to 80 °C. Should enable controlled temperature. |
| 2 mL screw neck glass vials | CSI Analytical Innovations | VT009M-1232 | For a larger scale, use 50 mL falcons and evaporate the chloroform using rotary evaporator. |
| 9mm Screw Cap | CSI Analytical Innovations | C395R-09LC | |
| C. Reagents required for step 3 (inner and feeding reaction mixtures): | |||
| HEPES | Spectrum | H1089 | 1 M HEPES-KOH (pH = 8) - pH buffer |
| Potassium hydroxide (KOH) | Frutarom | 55290 | |
| 1 M Magnesium acetate | Merck | 1.05819.0250 | Co-factor and negative charge stabilizor. |
| 1 M Potassium acetate | Carlo Erba | 470147 | Negative charge stabilizor. |
| 5.2 M Ammonium acetate | Merck | 1.01116.1000 | Stabilizes negative charge. |
| 50% (w/v) Polyethylene glycol 6000 (PEG) | Merck | 8.07491.1000 | Increases the concentration of the macromolecules. |
| 0.5 M 3-phosphoglycerate (3-PGA) | Sigma | P8877 | Secondary energy source. |
| 50 mM Amino acids mixture I | Sigma | LAA21-1KT | Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 17 natural amino acids - alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, proline, serine, threonine, and valine. |
| 50 mM Amino acids mixture II | Sigma | LAA21-1KT | Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 3 natural amino acids - tryptophan, phenylalanine, and tyrosine. |
| 100 mM Adenine triphosphate (ATP) | Sigma | A3377 | Nucleotides & energy source. |
| 50 mM Guanidine triphosphate (GTP) | Sigma | G8877 | Nucleotides & energy source. |
| 100 mM Uridine triphosphate (UTP) | ACROS ORGANICS | 226310010 | Nucleotides additive. |
| 100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | INALCO | INA-1758-1400 | Genes expression induction. |
| 2 M Sucrose | J.T. Baker | 1933078 | Generating a density gradient. |
| 2 M Glucose | Sigma | 16301 | Generating a density gradient. |
| H2O UltraPure Water (UPW) | Bio-Lab | 2321777500 | DNase & RNase free |
| S30-T7 lysate | _ | _ | Prepared at step 1. Source of transcription & translation components. Store at -80 °c, thaw on crashed ice just before usage. |
| Stock of DNA plasmid of choice | _ | _ | Contains the sequence for the requested protein. Under T7 promotor |
| D. Equipment required for step 4 (synthetic cells preparation) | |||
| Floor incubator shaker or Thermomixer | MRC | TOU-120-2 | Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C |
| PHMT Grant Bio | PSC18 | Thermomixer | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75004270 | (75003629) - TX-400 4 x 400mL Swinging Bucket Rotor. Suited for 15 mL sized tubes. Preferably swinging buckets. Should enable at least 1000 x g. Pre-cooled to 4 °C. |
| Table centrifuge | Thermo Scientific | 75002420 | (75003424) - 24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal. Suited for Eppendorf vials. Pre-cooled to 4 °C. |
| Vortex mixer | Scientific industries | SI-0256 | |
| Crushed ice bucket | Bel-Art | M18848-4001 | |
| 2 mL screw neck glass vials | CSI Analytical Innovations | VT009M-1232 | |
| Sterile 15 mL plastic tubes | Thermo Scientific | 339651 | |
| Sterilized 1.5 mL plastic tubes | Eppendorf | 30120086 | |
| Sterilized pipette tips | Corning | Sterilized by autoclave. |
References
- Blain, J. C., Szostak, J. W.
- Richmond, D. L., et al. Forming giant vesicles with controlled membrane composition, asymmetry, and contents. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (23), 9431-9436 (2011).
- Deshpande, S., Spoelstra, W. K., van Doorn, M., Kerssemakers, J., Dekker, C.
- Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. Streamlining Escherichia coli S30 extract preparation for economical cell-free protein synthesis. Biotechnology Progress. 21 (2), 460-465 (2005).
- Stano, P. Gene Expression Inside Liposomes: From Early Studies to Current Protocols. Chemistry-A European Journal. , (2019).
- Lewandowski, B., et al. Sequence-specific peptide synthesis by an artificial small-molecule machine. Science. 339 (6116), 189-193 (2013).
- Li, J., et al. Cogenerating synthetic parts toward a self-replicating system. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1327-1336 (2017).
- Kim, T. W., et al. An economical and highly productive cell-free protein synthesis system utilizing fructose-1,6-bisphosphate as an energy source. Journal of Biotechnology. 130 (4), 389-393 (2007).
- Kim, T. W., et al. Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 126 (4), 554-561 (2006).
- Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (51), 17669-17674 (2004).
- He, M., He, Y., Luo, Q., Wang, M. From DNA to protein: No living cells required. Process Biochemistry. 46 (3), 615-620 (2011).
- Casteleijn, M. G., Urtti, A., Sarkhel, S. Expression without boundaries: cell-free protein synthesis in pharmaceutical research. International Journal of Pharmaceutics. 440 (1), 39-47 (2013).
- Luisi, P. L., Ferri, F., Stano, P. Approaches to semi-synthetic minimal cells: a review. Naturwissenschaften. 93 (1), 1-13 (2006).
- Adamala, K. P., Martin-Alarcon, D. A., Guthrie-Honea, K. R., Boyden, E. S. Engineering genetic circuit interactions within and between synthetic minimal cells. Nature Chemistry. 9 (5), 431-439 (2017).
- Ding, Y., Contreras-Llano, L. E., Morris, E., Mao, M., Tan, C. Minimizing Context Dependency of Gene Networks Using Artificial Cells. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (36), 30137-30146 (2018).
- Arnold, F. H.
- Chen, Z., et al. Synthetic beta cells for fusion-mediated dynamic insulin secretion. Nature Chemical Biology. 14 (1), 86-93 (2018).
- Mohr, B. P., Retterer, S. T., Doktycz, M. J. While-you-wait proteins? Producing biomolecules at the point of need. Expert Review of Proteomics. 13 (8), 707-709 (2016).
- Krinsky, N., et al. Synthetic Cells Synthesize Therapeutic Proteins inside Tumors. Advanced Healthcare Materials. 7 (9), 1701163 (2018).
- Kim, T. W., Kim, D. M., Choi, C. Y. Rapid production of milligram quantities of proteins in a batch cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 124 (2), 373-380 (2006).
- Deng, N. N., Yelleswarapu, M., Zheng, L., Huck, W. T. Microfluidic assembly of monodisperse vesosomes as artificial cell models. Journal of the American Chemical Society. 139 (2), 587-590 (2016).
- Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nature Communications. 7, 10447 (2016).
- Göpfrich, K., et al. One-Pot Assembly of Complex Giant Unilamellar Vesicle-Based Synthetic Cells. ACS synthetic biology. , (2019).
- Fujii, S., et al. Liposome display for in vitro selection and evolution of membrane proteins. Nature Protocols. 9 (7), 1578 (2014).
- Periasamy, A., et al. Cell-free protein synthesis of membrane (1,3)-beta-d-glucan (curdlan) synthase: co-translational insertion in liposomes and reconstitution in nanodiscs. Biochim Biophys Acta. 1828 (2), 743-757 (2013).
- Kalmbach, R., et al. Functional cell-free synthesis of a seven helix membrane protein: in situ insertion of bacteriorhodopsin into liposomes. Journal of Molecular Biology. 371 (3), 639-648 (2007).
- Nishimura, K., et al. Cell-free protein synthesis inside giant unilamellar vesicles analyzed by flow cytometry. Langmuir. 28 (22), 8426-8432 (2012).
- Rampioni, G., et al. Synthetic cells produce a quorum sensing chemical signal perceived by Pseudomonas aeruginosa. Chemical Communications. 54 (17), 2090-2093 (2018).
- Stano, P., Kuruma, Y., de Souza, T. P., Luisi, P. L. Biosynthesis of proteins inside liposomes. , Humana Press. 127-145 (2010).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
- Krinsky, N., et al. A Simple and Rapid Method for Preparing a Cell-Free Bacterial Lysate for Protein Synthesis. PLoS One. 11 (10), 0165137 (2016).
- Pédelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 24 (1), 79 (2006).
- Osawa, M., Erickson, H. P. Liposome division by a simple bacterial division machinery. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (27), 11000-11004 (2013).
- Merkle, D., Kahya, N., Schwille, P. Reconstitution and anchoring of cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. ChemBioChem. 9 (16), 2673-2681 (2008).
- Vleugel, M., Roth, S., Groenendijk, C. F., Dogterom, M. Reconstitution of basic mitotic spindles in spherical emulsion droplets. Journal of Visualized Experiments. , e54278 (2016).
- Bayoumi, M., Bayley, H., Maglia, G., Sapra, K. T. Multi-compartment encapsulation of communicating droplets and droplet networks in hydrogel as a model for artificial cells. Scientific Reports. 7, 45167 (2017).
- Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: applications come of age. Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).
