Perfusion et stimulation combinées avec voltampérométrie cyclique à balayage rapide (CIS-FSCV) pour évaluer la régulation du récepteur de la zone tegmentale ventrale de la dopamine phasique
Summary
L’objectif de ce protocole est de manipuler directement les récepteurs de la zone tegmentale ventrale pour étudier leur contribution à la libération subseconde de dopamine.
Abstract
La libération phasique de dopamine (DA) de la zone tegmentale ventrale (VTA) vers le noyau accumbens joue un rôle central dans le traitement de la récompense et l’apprentissage par renforcement. Comprendre comment les diverses entrées neuronales dans la libération phasique de DA de contrôle VTA peuvent fournir une meilleure image des circuits qui contrôlent le traitement des récompenses et l’apprentissage par renforcement. Nous décrivons ici une méthode qui combine des perfusions intra-VTA d’agonistes et d’antagonistes pharmacologiques avec une libération phasique de DA évoquée par stimulation (perfusion et stimulation combinées, ou CIS) mesurée par voltampérométrie cyclique à balayage rapide in vivo (FSCV). En utilisant CIS-FSCV chez des rats anesthésiés, une réponse DA phasique peut être évoquée en stimulant électriquement le VTA avec une électrode bipolaire équipée d’une canule tout en enregistrant dans le noyau accumbens. Les agonistes ou antagonistes pharmacologiques peuvent être perfusés directement au site de stimulation pour étudier les rôles spécifiques des récepteurs VTA dans la libération phasique de DA. Un avantage majeur de CIS-FSCV est que la fonction du récepteur VTA peut être étudiée in vivo, en s’appuyant sur des études in vitro.
Introduction
La libération phasique de dopamine (DA) de la zone tegmentale ventrale (VTA) vers le noyau accumbens (NAc) joue un rôle vital dans les comportements liés à la récompense. Les neurones VTA DA passent d’un tir de type tonique (3-8 Hz) à un tir de type rafale (>14 Hz)1, qui produit une libération phasique de DA dans le NAc. Le VTA exprime une variété de récepteurs somatodendritiques qui sont bien positionnés pour contrôler le passage du tonique au déclenchement en rafale2,3,4,5. L’identification de ceux de ces récepteurs, et de leurs entrées respectives, contrôle la libération phasique de DA approfondira notre compréhension de la façon dont les circuits liés à la récompense sont organisés. Le but de la méthodologie décrite ici, combinée à la perfusion et à la stimulation avec la voltampérométrie cyclique à balayage rapide (CIS-FSCV), est d’évaluer rapidement et de manière robuste la fonctionnalité des récepteurs VTA dans la conduite de la libération phasique de DA.
Le terme perfusion et stimulation combinées (CIS) fait référence à la manipulation pharmacologique des récepteurs sur un groupe de neurones (ici le VTA) et à la stimulation de ces neurones pour étudier la fonction du récepteur. Chez le rat anesthésié, nous stimulons électriquement le VTA pour évoquer un grand signal DA phasique (1-2 μM) dans le noyau NAc, tel que mesuré par voltampérométrie cyclique à balayage rapide (FSCV). Les perfusions de médicaments pharmacologiques (c.-à-d. agonistes/antagonistes des récepteurs) au site de stimulation peuvent être utilisées pour mesurer la fonction des récepteurs VTA en observant le changement subséquent dans la libération phasique évoquée de DA. FscV est une approche électrochimique qui bénéficie à la fois d’une résolution spatiale (50-100 μm) et temporelle (10 Hz) élevée, et est bien adaptée pour mesurer les événements DA phasiques liés à la récompense6,7. Cette résolution est plus fine que d’autres mesures neurochimiques in vivo, telles que la microdialyse. Ainsi, ensemble, CIS-FSCV est bien adapté pour évaluer la régulation des récepteurs VTA de la libération phasique de dopamine.
Une façon courante d’étudier la fonction du récepteur VTA consiste à utiliser une combinaison d’approches électrophysiologiques qui traitent de la façon dont ces récepteurs modifient la vitesse de tir des neurones1,8. Ces études sont très utiles pour comprendre quels récepteurs sont impliqués dans le déclenchement de DA lors de l’activation. Cependant, ces études ne peuvent que suggérer ce qui pourrait se produire en aval au terminal axonal (c.-à-d. libération d’un neurotransmetteur). CIS-FSCV s’appuie sur ces études électrophysiologiques en répondant à la façon dont la sortie du déclenchement en rafale de VTA, la libération phasique de DA, est régulée par des récepteurs situés sur les dendrites VTA et les corps cellulaires. Ainsi, CIS-FSCV est bien adapté pour s’appuyer sur ces études d’électrophysiologie. À titre d’exemple, l’activation des récepteurs nicotiniques peut induire un déclenchement en rafale dans le VTA9,et le CIS-FSCV chez le rat anesthésié a été utilisé pour montrer que l’activation du récepteur nicotinique de l’acétylcholine (nAChR) dans le VTA contrôle également la libération phasique de DA dans le NAc10,11.
L’examen mécaniste de la régulation phasique de l’AD est également couramment étudié en utilisant des préparations de tranches parallèlement à l’application de médicaments au bain. Ces études se concentrent souvent sur la régulation présynaptique de la libération phasique de DA par les terminaux dopaminergiques, car les corps cellulaires sont souvent retirés de la tranche12. Ces préparations sont précieuses pour étudier les effets des récepteurs présynaptiques sur les terminaux dopaminergiques, tandis que cis-FSCV est mieux adapté pour étudier les effets des récepteurs somatodendritiques sur les neurones dopaminergiques, ainsi que les entrées présynaptiques à la VTA. Cette distinction est importante, car l’activation du récepteur somatodendritique dans l’ATV peut avoir un effet différent de celui de l’activation du récepteur présynaptique NAc. En effet, le blocage des nAChRs présynaptiques dopaminergiques dans le NAc peut élever la libération phasique de dopamine lors du tir en rafale13,alors que l’inverse est vrai chez VTA somatodendritc nAChRs10,11.
CIS-FSCV est une approche idéale pour étudier la capacité des récepteurs VTA à réguler la libération phasique de DA. Il est important de noter que cette approche peut être effectuée chez un rat intact, qu’il soit anesthésié ou en mouvement libre. Cette approche convient aux études aiguës, à l’étude de la fonction des récepteurs dans son état de base10,14 ainsi qu’aux études à long terme qui peuvent évaluer les changements fonctionnels dans un récepteur après une exposition à un médicament ou une manipulation comportementale11,15.
Protocol
Representative Results
Discussion
CIS-FSCV offre une occasion unique d’étudier les mécanismes des récepteurs VTA sous-jacents à la libération phasique de DA. Il y a deux étapes critiques afin d’assurer un enregistrement correct. Tout d’abord, un enregistrement de base stable doit être réalisé, avec peu de dérive dans le signal DA évoqué. Un moyen important d’augmenter la probabilité d’établir un enregistrement stable est de s’assurer que l’électrode a eu suffisamment de temps pour tourner à la fois à 60 Hz et 10 Hz (génér…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les travaux ont été soutenus par Elizabethtown College (R.J.W, M.L. et L.M.), par une bourse d’études supérieures de la NSF (R.J.W.) et par la Yale School of Medicine (N.A.).
Materials
| Electrode Filling Solution/Supplies | |||
| Micropipette | World Precision Instruments | MF286-5 (28 gauge) | |
| Potassium Acetate | Sigma | 236497-100G | |
| Potassium Chloride | Sigma | P3911-25G | |
| Electrode Supplies | |||
| Carbon fiber | Thornel | T650 | |
| Electrode puller | Narishige International | PE-22 | Note: horizontal pullers can be used as well |
| Glass capillary | A-M systems | 626000 | |
| Insulated wires for electrodes | Weico Wire and Cable Incorporated | UL 1423 | Length; 10 cm; diameter,0.4mm; must get custom made; insulated material should cover 5 cm of the wire |
| Light Microscope (for viewing and cutting electrode) | Fischer Scientific | M3700 | |
| Pin | Phoenix Enterprises | HWS1646 | To be soldered onto the insuled electrode wire and reference electrode; connects to headstage |
| Putty | Alcolin | 23922-1003 | Used to place electrode on while cutting the carbon fiber |
| Scalpal Blade | World Precision Instruments | 500239 | For cutting carbon fiber to the apprpriate length |
| Silver Wire | Sigma | 327026-4G | |
| FSCV Hardware/Software | |||
| Faraday Cage | U-Line | H-3618 (36" x 24" x 42") | |
| Potentiostat | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | ||
| Stimulating electrode | PlasticsOne | MS303/2-A/SPC | when ordering, request a 22 mm cut below pedestal |
| TarHeel HDCV Software | University of North Carolina-Chapel Hill | – | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information |
| UEI breakout box | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information | |
| UEI power supply | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information | |
| Stimulator Hardware | |||
| Neurolog stimulus isolator | Digitimer Ltd. | DS4 | Neurolog 800A |
| Infusion/Stimulation Supplies | |||
| Infusion Pump | New Era Syringe Pump | NE-300 | |
| Internal Cannula | PlasticsOne | C315I/SPC INTERNAL 33GA | |
| Microliter Syringe | Hamilton | 80308 | |
| Tubing | PlasticsOne | C313CT/ PKG TUBING 023 X 050 PE50 | |
| Surgical Supplies | |||
| Cannula Holder | Kopf Instruments | 1776 P-1 | |
| Cotton Tip Applicators | Vitality Medical | 806 | |
| Electrode Holder | Kopf Instruments | 1770 | |
| Heating Pad | Kent Scientific | RT-0501 | |
| Povidone Iodine | Vitality Medical | 29906-004 | |
| Screws | Stoelting | Bone Anchor Screws/Pkg.of 100 | 1.59 mm O.D., 3.2 mm long |
| Silver wire reference with AgCl | InVivo Metric | E255A | |
| Square Gauze | Vitality Medical | 441408 | |
| Stereotax | Kopf Instruments | Model 902 (Dual Arm Bar) | |
| Histological Supplies | |||
| Formulin | Sigma | 1004960700 | |
| Power supply | BK Precision | 9110 | |
| Sucrose | Sigma | 80497 | |
| Tungsten microelectrode | MicroProbes | WE30030.5A3 | |
| Drugs for infusions | |||
| ((2R)-amino-5-phosphonovaleric acid | Sigma Aldrich | A5282 | |
| N-methyl-D-aspartate | Sigma Aldrich | M3262 | |
| Mecamylamine hydrochloride (M9020-5mg) | Sigma Aldrich | M9020 | |
| Scopolamine hydrobromide (S0929-1g) | Sigma Aldrich | S0929 |
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