Infusión y estimulación combinadas con voltamperometría cíclica de exploración rápida (CIS-FSCV) para evaluar la regulación del receptor del área tegmental ventral de la dopamina fásica
Summary
El objetivo de este protocolo es manipular directamente los receptores del área tegmental ventral para estudiar su contribución a la liberación de dopamina de subsectores.
Abstract
La liberación de dopamina fásica (DA) desde el área tegmental ventral (VTA) al núcleo accumbens juega un papel fundamental en el procesamiento de recompensas y el aprendizaje por refuerzo. Comprender cómo las diversas entradas neuronales en la liberación de DA fásica de control VTA puede proporcionar una mejor imagen de los circuitos que controlan el procesamiento de recompensas y el aprendizaje por refuerzo. Aquí, describimos un método que combina infusiones de cánula intra-VTA de agonistas farmacológicos y antagonistas con liberación de DA fásica evocada por estimulación (infusión y estimulación combinadas, o CIS) medida por voltamperometría cíclica de exploración rápida in vivo (FSCV). Usando CIS-FSCV en ratas anestesiadas, se puede evocar una respuesta da fásica estimulando eléctricamente el VTA con un electrodo bipolar equipado con una cánula mientras se registra en el núcleo accumbens core. Los agonistas o antagonistas farmacológicos se pueden infundir directamente en el sitio de estimulación para investigar el papel específico de los receptores VTA en la conducción de la liberación de DA fásica. Un beneficio importante de CIS-FSCV es que la función del receptor VTA se puede estudiar in vivo, basándose en estudios in vitro.
Introduction
La liberación de dopamina fásica (DA) desde el área tegmental ventral (VTA) al núcleo accumbens (NAc) juega un papel vital en los comportamientos relacionados con la recompensa. Las neuronas VTA DA cambian de un disparo tónico (3-8 Hz) a un disparo en forma de ráfaga (>14 Hz)1, que produce la liberación fásica de DA en el NAc. El VTA expresa una variedad de receptores somatodendríticos que están bien posicionados para controlar el cambio de tónico a disparo de ráfaga2,3,4,5. Identificar cuál de estos receptores, y sus respectivas entradas, controla la liberación de DA fásico profundizará nuestra comprensión de cómo se organizan los circuitos relacionados con la recompensa. El propósito de la metodología descrita aquí, la infusión y estimulación combinadas con voltamperometría cíclica de exploración rápida (CIS-FSCV), es evaluar de manera rápida y robusta la funcionalidad de los receptores VTA para impulsar la liberación de DA fásica.
El término infusión y estimulación combinadas (CIS) se refiere a la manipulación farmacológica de los receptores en un grupo de neuronas (aquí el VTA) y la estimulación de esas neuronas para estudiar la función del receptor. En la rata anestesiada, estimulamos eléctricamente el VTA para evocar una gran señal de DA fásica (1-2 μM) en el núcleo de NAc, medida por voltamperometría cíclica de escaneo rápido (FSCV). Las infusiones de fármacos farmacológicos (es decir, agonistas/antagonistas de los receptores) en el sitio de estimulación se pueden utilizar para medir la función de los receptores VTA observando el cambio posterior en la liberación de DA fásica evocada. FSCV es un enfoque electroquímico que goza de una alta resolución espacial (50-100 μm) y temporal (10 Hz), y es muy adecuado para medir eventos DA fásicos relacionados con la recompensa6,7. Esta resolución es más fina que otras mediciones neuroquímicas in vivo, como la microdiálisis. Por lo tanto, en conjunto, CIS-FSCV es muy adecuado para evaluar la regulación del receptor VTA de la liberación de dopamina fásica.
Una forma común de investigar la función del receptor VTA es mediante el uso de una combinación de enfoques electrofisiológicos que abordan cómo esos receptores alteran la velocidad de disparo de las neuronas1,8. Estos estudios son muy valiosos para comprender qué receptores están involucrados en la conducción de la activación de DA tras la activación. Sin embargo, estos estudios solo pueden sugerir lo que podría suceder aguas abajo en el terminal del axón (es decir, la liberación de un neurotransmisor). CIS-FSCV se basa en estos estudios electrofisiológicos al responder cómo la salida de VTA de disparo de ráfaga, liberación de DA fásica, está regulada por receptores ubicados en dendritas VTA y cuerpos celulares. Por lo tanto, CIS-FSCV es muy adecuado para construir sobre estos estudios de electrofisiología. Como ejemplo, la activación del receptor nicotínico puede inducir la activación de ráfagas en el VTA9,y CIS-FSCV en la rata anestesiada se utilizó para demostrar que la activación del receptor nicotínico de acetilcolina (nAChR) en el VTA también controla la liberación de DA fásica en el NAc10,11.
El examen mecanicista de la regulación fásica de la DA también se estudia comúnmente utilizando preparaciones de rebanadas junto con la aplicación de medicamentos en el baño. Estos estudios a menudo se centran en la regulación presináptica de la liberación de DA fásica de los terminales de dopamina, ya que los cuerpos celulares a menudo se eliminan de la rebanada12. Estas preparaciones son valiosas para estudiar los efectos de los receptores presinápticos en las terminales de dopamina, mientras que CIS-FSCV es más adecuado para estudiar los efectos de los receptores somatodendríticos en las neuronas dopaminérgicas, así como las entradas presinápticas al VTA. Esta distinción es importante, porque la activación del receptor somatodendrítico en el VTA puede tener un efecto diferente que la activación del receptor presináptico NAc. De hecho, el bloqueo de los nAChRs presinápticos dopaminérgicos en el NAc puede elevar la liberación de dopamina fásica durante la ráfaga13,mientras que lo contrario es cierto en VTA somatodendritc nAChRs10,11.
CIS-FSCV es un enfoque ideal para estudiar la capacidad de los receptores VTA para regular la liberación de DA fásica. Es importante destacar que este enfoque se puede realizar en una rata intacta, ya sea anestesiada o en movimiento libre. Este enfoque es adecuado para estudios agudos, para estudiar la función del receptor en su estado basal10,14, así como estudios a largo plazo que pueden evaluar cambios funcionales en un receptor después de la exposición al fármaco o la manipulación conductual11,15.
Protocol
Representative Results
Discussion
CIS-FSCV ofrece una oportunidad única para investigar los mecanismos del receptor VTA subyacentes a la liberación de DA fásica. Hay dos pasos críticos para garantizar una grabación adecuada. En primer lugar, se debe lograr un registro de referencia estable, con poca deriva en la señal DA evocada. Una forma importante de aumentar la probabilidad de establecer una grabación estable es asegurarse de que el electrodo haya tenido suficiente tiempo para circular tanto a 60 Hz como a 10 Hz (generalmente 15 minutos a 60 H…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El trabajo fue apoyado por Elizabethtown College (R.J.W, M.L. y L.M.), por una beca de posgrado de NSF (R.J.W.) y por la Escuela de Medicina de Yale (N.A.).
Materials
| Electrode Filling Solution/Supplies | |||
| Micropipette | World Precision Instruments | MF286-5 (28 gauge) | |
| Potassium Acetate | Sigma | 236497-100G | |
| Potassium Chloride | Sigma | P3911-25G | |
| Electrode Supplies | |||
| Carbon fiber | Thornel | T650 | |
| Electrode puller | Narishige International | PE-22 | Note: horizontal pullers can be used as well |
| Glass capillary | A-M systems | 626000 | |
| Insulated wires for electrodes | Weico Wire and Cable Incorporated | UL 1423 | Length; 10 cm; diameter,0.4mm; must get custom made; insulated material should cover 5 cm of the wire |
| Light Microscope (for viewing and cutting electrode) | Fischer Scientific | M3700 | |
| Pin | Phoenix Enterprises | HWS1646 | To be soldered onto the insuled electrode wire and reference electrode; connects to headstage |
| Putty | Alcolin | 23922-1003 | Used to place electrode on while cutting the carbon fiber |
| Scalpal Blade | World Precision Instruments | 500239 | For cutting carbon fiber to the apprpriate length |
| Silver Wire | Sigma | 327026-4G | |
| FSCV Hardware/Software | |||
| Faraday Cage | U-Line | H-3618 (36" x 24" x 42") | |
| Potentiostat | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | ||
| Stimulating electrode | PlasticsOne | MS303/2-A/SPC | when ordering, request a 22 mm cut below pedestal |
| TarHeel HDCV Software | University of North Carolina-Chapel Hill | – | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information |
| UEI breakout box | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information | |
| UEI power supply | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information | |
| Stimulator Hardware | |||
| Neurolog stimulus isolator | Digitimer Ltd. | DS4 | Neurolog 800A |
| Infusion/Stimulation Supplies | |||
| Infusion Pump | New Era Syringe Pump | NE-300 | |
| Internal Cannula | PlasticsOne | C315I/SPC INTERNAL 33GA | |
| Microliter Syringe | Hamilton | 80308 | |
| Tubing | PlasticsOne | C313CT/ PKG TUBING 023 X 050 PE50 | |
| Surgical Supplies | |||
| Cannula Holder | Kopf Instruments | 1776 P-1 | |
| Cotton Tip Applicators | Vitality Medical | 806 | |
| Electrode Holder | Kopf Instruments | 1770 | |
| Heating Pad | Kent Scientific | RT-0501 | |
| Povidone Iodine | Vitality Medical | 29906-004 | |
| Screws | Stoelting | Bone Anchor Screws/Pkg.of 100 | 1.59 mm O.D., 3.2 mm long |
| Silver wire reference with AgCl | InVivo Metric | E255A | |
| Square Gauze | Vitality Medical | 441408 | |
| Stereotax | Kopf Instruments | Model 902 (Dual Arm Bar) | |
| Histological Supplies | |||
| Formulin | Sigma | 1004960700 | |
| Power supply | BK Precision | 9110 | |
| Sucrose | Sigma | 80497 | |
| Tungsten microelectrode | MicroProbes | WE30030.5A3 | |
| Drugs for infusions | |||
| ((2R)-amino-5-phosphonovaleric acid | Sigma Aldrich | A5282 | |
| N-methyl-D-aspartate | Sigma Aldrich | M3262 | |
| Mecamylamine hydrochloride (M9020-5mg) | Sigma Aldrich | M9020 | |
| Scopolamine hydrobromide (S0929-1g) | Sigma Aldrich | S0929 |
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