Summary
L'obiettivo di questo protocollo è quello di manipolare direttamente i recettori dell'area tegmentale ventrale per studiare il loro contributo al rilascio di dopamina al di sottosecondo.
Abstract
Il rilascio di dopamina fasica (DA) dall'area tegmentale ventrale (VTA) al nucleo accumbens svolge un ruolo fondamentale nell'elaborazione della ricompensa e nell'apprendimento per rinforzo. Comprendere come i diversi input neuronali nel rilascio di DA fasico di controllo VTA può fornire un quadro migliore dei circuiti che controllano l'elaborazione della ricompensa e l'apprendimento per rinforzo. Qui, descriviamo un metodo che combina infusioni di cannule intra-VTA di agonisti e antagonisti farmacologici con rilascio di DA fasico evocato dalla stimolazione (infusione e stimolazione combinate, o CIS) misurato mediante voltammetria ciclica a scansione rapida in vivo (FSCV). Utilizzando CIS-FSCV in ratti anestetizzati, una risposta DA fasica può essere evocata stimolando elettricamente il VTA con un elettrodo bipolare dotato di una cannula durante la registrazione nel nucleo accumbens. Gli agonisti o gli antagonisti farmacologici possono essere infusi direttamente nel sito di stimolazione per studiare i ruoli specifici dei recettori VTA nel guidare il rilascio di DA fasico. Uno dei principali vantaggi di CIS-FSCV è che la funzione del recettore VTA può essere studiata in vivo, basandosi su studi in vitro.
Introduction
Il rilascio di dopamina fasica (DA) dall'area tegmentale ventrale (VTA) al nucleo accumbens (NAc) svolge un ruolo vitale nei comportamenti legati alla ricompensa. I neuroni VTA DA passano da un fuoco tonico (3-8 Hz) a un fuoco a raffica (>14 Hz)1, che produce il rilascio di DA fasico nel NAc. Il VTA esprime una varietà di recettori somatodendritici che sono ben posizionati per controllare il passaggio da tonico a scoppio2,3,4,5. Identificare quali di questi recettori e i loro rispettivi input controllano il rilascio di DA fasico approfondirà la nostra comprensione di come è organizzato il circuito correlato alla ricompensa. Lo scopo della metodologia qui descritta, combinata di infusione e stimolazione con voltammetria ciclica a scansione rapida (CIS-FSCV), è quello di valutare rapidamente e in modo robusto la funzionalità dei recettori VTA nel guidare il rilascio di DA fasico.
Il termine infusione e stimolazione combinata (CIS) si riferisce alla manipolazione farmacologica dei recettori su un gruppo di neuroni (qui il VTA) e alla stimolazione di quei neuroni a studiare la funzione del recettore. Nel ratto anestetizzato, stimoliamo elettricamente il VTA per evocare un grande segnale DA fasico (1-2 μM) nel nucleo NAc, misurato mediante voltammetria ciclica a scansione rapida (FSCV). Infusioni di farmaci farmacologici (cioè agonisti/antagonisti del recettore) nel sito di stimolazione possono essere utilizzate per misurare la funzione dei recettori VTA osservando il successivo cambiamento nel rilascio di DA fasico evocato. FSCV è un approccio elettrochimico che gode di un'elevata risoluzione spaziale (50-100 μm) e temporale (10 Hz) ed è adatto per misurare eventi DA fasici correlati alla ricompensa6,7. Questa risoluzione è più fine di altre misurazioni neurochimiche in vivo, come la microdialisi. Pertanto, insieme, CIS-FSCV è adatto per valutare la regolazione del recettore VTA del rilascio di dopamina fasica.
Un modo comune per studiare la funzione del recettore VTA è utilizzando una combinazione di approcci elettrofisiologici che affrontano il modo in cui tali recettori alterano la velocità di attivazione dei neuroni1,8. Questi studi sono molto preziosi per capire quali recettori sono coinvolti nel guidare l'attivazione di DA al momento dell'attivazione. Tuttavia, questi studi possono solo suggerire cosa potrebbe accadere a valle del terminale assonale (cioè il rilascio di un neurotrasmettitore). CIS-FSCV si basa su questi studi elettrofisiologici rispondendo a come l'output del rilascio di DA fasico del VTA è regolato dai recettori situati sui dendriti VTA e sui corpi cellulari. Pertanto, CIS-FSCV è adatto per costruire su questi studi di elettrofisiologia. Ad esempio, l'attivazione del recettore nicotinico può indurre scoppi nel VTA9e CIS-FSCV nel ratto anestetizzato è stato usato per dimostrare che l'attivazione del recettore nicotinico dell'acetilcolina (nAChR) nel VTA controlla anche il rilascio di DA fasico nel NAc10,11.
L'esame meccanicistico della regolazione da DA fasica è anche comunemente studiato utilizzando preparazioni a fette insieme all'applicazione del bagno di farmaci. Questi studi si concentrano spesso sulla regolazione presinaptica del rilascio di DA fasico dai terminali della dopamina, poiché i corpi cellulari vengono spesso rimossi dalla fetta12. Questi preparati sono preziosi per studiare gli effetti dei recettori presinaptici sui terminali della dopamina, mentre CIS-FSCV è più adatto per studiare gli effetti del recettore somatodendritico sui neuroni della dopamina, così come gli input presinaptici al VTA. Questa distinzione è importante, perché l'attivazione del recettore somatodendritico nel VTA può avere un effetto diverso rispetto all'attivazione del recettore presinaptico NAc. In effetti, il blocco dei nAChR presinaptici dopaminergici nel NAc può elevare il rilascio di dopamina fasica durante la raffica13, mentre il contrario è vero a VTA somatodendritc nAChRs10,11.
CIS-FSCV è un approccio ideale per studiare la capacità dei recettori VTA di regolare il rilascio di DA fasico. È importante sottolineare che questo approccio può essere eseguito in un ratto intatto, anestetizzato o in movimento libero. Questo approccio è adatto per studi acuti, per studiare la funzione del recettore nel suo stato basale10,14 e studi a lungo termine in grado di valutare i cambiamenti funzionali in un recettore dopo l'esposizione al farmaco o la manipolazione comportamentale11,15.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sono stati condotti secondo la Guida del National Institutes of Health (NIH) per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e sono stati approvati sia dall'Elizabethtown College che dal Yale University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Questo protocollo è specifico per la preparazione di ratti anestetizzati dell'utilizzo di CIS-FSCV.
1. Preparazioni prechirurgiche
- Preparazione della soluzione di elettrodi
- Per realizzare la soluzione di riempimento dell'elettrodo, preparare una soluzione di acetato di potassio 4 M con cloruro di potassio140mM 16 .
- Preparazione degli elettrodi
- Utilizzando l'aspirazione sottovuoto, inserire una fibra di carbonio T-650 (7 μm di diametro) in un capillare di vetro borosilicato (lunghezza = 100 mm, diametro = 1,0 mm, diametro interno = 0,5 mm).
- Una volta che la fibra di carbonio è stata posizionata all'interno del capillare di vetro, posizionare il capillare di vetro in un estrattore di elettrodi verticale, con l'elemento termico all'incirca al centro del capillare. Impostare il riscaldatore su 55 con il magnete spento.
- Dopo aver tirato il capillare, sollevare con attenzione il supporto capillare superiore in modo che la punta dell'elettrodo non sia circondata dall'elemento riscaldante.
- Usando forbici affilate, tagliare la fibra di carbonio che sta ancora collegando i due pezzi del capillare. Ciò si tradurrà in due microelettrodi separati in fibra di carbonio.
- Al microscopio ottico, tagliare con cura la fibra di carbonio esposta con un bisturi affilato, in modo che la fibra di carbonio si estenda di circa 75-100 μm oltre l'estremità del vetro.
- Utilizzando un microscopio ottico, assicurarsi che l'elettrodo sia privo di crepe lungo il capillare. Assicurarsi inoltre che la guarnizione, dove la fibra di carbonio esce dal capillare, sia difficile da notare e priva di crepe.
NOTA: una buona tenuta aiuterà a ridurre il rumore durante le registrazioni. Vedi gli studi pubblicati17,18,19 per un protocollo più dettagliato.
- Fabbricazione di elettrodi di riferimento
- Saldare una spilla d'oro su un filo d'argento di 5 cm.
- Collegare l'anodo a una graffetta metallica o altro conduttore, il catodo a un perno e applicare una tensione (~ 2 V) mentre la graffetta e il filo d'argento sono immersi in 0,1 M HCl.
- Cessare la tensione una volta che un rivestimento bianco (AgCl) appare sul filo d'argento.
- Preparazione dell'elettrodo per l'impianto
- Saldare un perno d'oro su un sottile filo isolato (~ 10 cm di lunghezza, <0,50 mm di diametro).
- Rimuovere ~ 5 cm di isolamento dal filo opposto al perno d'oro.
- Riempire l'elettrodo circa a metà strada con la soluzione dell'elettrodo.
- Inserire il filo isolato nell'elettrodo.
NOTA: il filo deve entrare in contatto con la fibra di carbonio all'interno dell'elettrodo.
2. Impianti di elettrodi
- Somministrare ai ratti Sprague Dawley adulti, maschi (250-450 g) un'iniezione intraperitoneale (1,5 g/kg o 1 ml/kg di volume) di 0,5 g/mL di uretano disciolto in soluzione salina sterile. Iniziare con una dose iniziale di uretano di 1,0-1,2 g/kg. Se l'animale risponde ancora al test di stimolo nocivo (pizzico di coda) 20 minuti dopo la somministrazione di uretano, somministrare un ulteriore 0,3-0,5 g/kg di uretano per una dose totale di 1,5 g/kg.
NOTA: Per la preparazione della soluzione di uretano da 0,5 g/mL, aggiungere 10 g di uretano a 10 g (~10 ml) di soluzione salina. L'uretano è cancerogeno e deve essere maneggiato con cura. L'uretano è un anestetico importante, in quanto non altera i livelli di dopamina, come fanno altri anestetici come ketamina / xilazina e idrato di cloralio20,21. - Una volta che l'animale è profondamente anestetizzato e non risponde a stimoli nocivi (ad esempio, pizzicamento della punta), posizionalo nella cornice stereotassica. Applicare lubrificante oftalmico su ciascun occhio del ratto.
NOTA: Questo è un intervento chirurgico non di sopravvivenza, ma è incoraggiata una buona tecnica asettica. - Pulire il cuoio capelluto del ratto usando uno scrub a due stadi (cioè uno scrub allo iodopovidone seguito da uno scrub all'etanolo al 70%; eseguire una ripetizione di 3 cicli).
- Tagliare via il tessuto del cuoio capelluto usando pinzette per il naso ad ago sterilizzate e forbici chirurgiche. Rimuovere una quantità significativa di tessuto per fare spazio ai vari impianti descritti di seguito.
- Pulire delicatamente la superficie del cranio utilizzando applicatori di punta in cotone sterilizzato. Quindi applicare 2-3 gocce di perossido di idrogeno al 3% per aiutare a identificare la lambda e il bregma.
- Utilizzando un trapano stereotassico o a mano (1,0 mm, ~ 20.000 giri / min), praticare un foro di 1,5 mm di diametro 2,5 mm anteriore al bregma e 3,5 mm laterale al bregma. Parzialmente (circa a metà strada, fino a quando non è saldamente in posizione) impiantare una vite (1,59 mm O.D., 3,2 mm di lunghezza) in questo foro. Si consiglia di utilizzare soluzione salina sterile per irrigare durante la perforazione per prevenire lesioni termiche.
- Per l'elettrodo di riferimento, praticare un foro di 1,0 mm di diametro 1,5 mm anteriore e 3,5 mm laterale al bregma, nell'emisfero sinistro.
- A mano, inserire ~ 2 mm di filo di riferimento in questo foro, avvolgendo il filo di riferimento intorno e sotto la testa della vite impiantata.
- Impiantare completamente la vite, bloccando l'elettrodo di riferimento in posizione.
- Nell'emisfero destro, praticare un foro di 1,5 mm di diametro 1,2 mm anteriore e 1,4 mm laterale al bregma.
- Rimuovere delicatamente la dura usando una pinzetta.
- Per l'elettrodo stimolante, praticare un foro quadrato (2 mm anteriore-posteriore, 5 mm mediale-laterale) centrato a 5,2 mm posteriore e 1,0 mm laterale al bregma.
- Utilizzando le barre del braccio stereotassico, abbassare l'elettrodo/cannula guida di stimolazione bipolare di 5 mm sotto la dura. In caso di sanguinamento durante l'impianto dell'elettrodo, utilizzare tamponi di cotone sterili e garze per ridurre al minimo il sanguinamento.
NOTA: L'elettrodo stimolante bipolare utilizzato in questo metodo è premontato con una cannula guida (Tabella dei materiali). La cannula interna utilizzata con questo articolo deve essere lavata con i rebbi sull'elettrodo stimolante bipolare quando completamente inserita nella cannula di guida. Ciò consentirà alla cannula interna di sedersi direttamente tra i due poli dello stimolatore, che si trovano a circa 1 mm di distanza. Un protocollo simile è descritto altrove14. - Utilizzando le barre del braccio stereotassico, abbassare il microelettrodo in fibra di carbonio di 4 mm sotto la dura. Questa posizione è nella parte più dorsale dello striato.
- Collegare il filo di riferimento e la fibra di carbonio a un potenziostato.
- Applicare una forma d'onda triangolare (-0,4−1,3 V, 400 V/s) per 15 min a 60 Hz, e di nuovo per 10 min a 10 Hz.
NOTA: In genere, quando si applicano forme d'onda ai microelettrodi in fibra di carbonio nel cervello, i gruppi di ossido vengono aggiunti alla superficie della fibra di carbonio. L'equilibrio di questa reazione deve essere raggiunto prima della registrazione; altrimenti si verificherà una deriva significativa19. Il ciclo dell'elettrodo a frequenze più elevate (60 Hz) consente alla fibra di carbonio di raggiungere l'equilibrio più velocemente.
3. Ottimizzazione della fibra di carbonio e stimolazione delle posizioni dell'elettrodo / cannula guida
- Impostare lo stimolatore per produrre una forma d'onda elettrica bipolare, con una frequenza di 60 Hz, 24 impulsi, corrente di 300 μA e larghezza di impulso di 2 ms/fase.
- Abbassare delicatamente lo stimolatore con incrementi di 0,2 mm da 5 mm a 7,8 mm sotto la dura. Ad ogni incremento, stimolare il VTA.
NOTA: a più profondità dorsali (5-6 mm), la stimolazione del cervello in genere (~ 80% delle volte) causa la contrazione dei baffi del ratto. A profondità ulteriori, i baffi cesseranno di contrarsi, che si verifica tra 7,5-8,2 mm sotto la dura. Quando i baffi cessano di contrarsi, l'elettrodo stimolante sarà vicino o al VTA. Ciò non si verifica in ogni ratto e la mancanza di contrazioni dei baffi non deve essere presa come un segno che l'elettrodo/cannula bipolare stimolante/cannula per infusione è fuori posto. Le contrazioni dei baffi potrebbero non verificarsi per tutti gli anestetici (ad esempio, isoflurano). - Continuare ad abbassare l'elettrodo/cannula guida stimolante bipolare fino a quando una stimolazione produce un rilascio di DA fasico nel microelettrodo in fibra di carbonio (attualmente nello striato dorsale).
NOTA: il rilascio di DA nello striato dorsale non si verifica sempre se l'elettrodo bipolare viene impiantato nel VTA, ma l'osservazione del rilascio di DA nello striato dorsale dopo la stimolazione VTA è di solito un buon segno che un buon segnale sarà osservato nel nucleo NAc. - Abbassare il microelettrodo in fibra di carbonio fino a quando non si trova ad almeno 6,0 mm sotto la dura. Questa è la parte più dorsale del nucleo NAc.
- Stimolare il VTA e registrare l'ampiezza di picco del picco DA.
- Abbassare o sollevare il microelettrodo in fibra di carbonio nel sito che produce il maggior rilascio di DA.
- Assicurarsi che il picco della risposta DA sia un chiaro picco di ossidazione a 0,6 V e un picco di riduzione a -0,2 V. Questi picchi sono indicativi di DA.
4. Combinazione infusione e stimolazione registrazione FSCV
NOTA: la Figura 1 mostra la sequenza temporale per la registrazione prima e dopo la microinfusione VTA.
- Una volta ottimizzata la posizione della fibra di carbonio e della cannula dell'elettrodo / guida stimolante, stimolare per ~ 20-30 min.
NOTA: Sotto gli attuali parametri di stimolazione, non stimolare più di una volta ogni 3 minuti, per consentire la ricarica vescicolare22. - Dopo aver raggiunto una linea di base stabile (variazione <20% su cinque stimolazioni), abbassare delicatamente la cannula interna a mano nella cannula guida che è prefigurata nello stimolatore bipolare.
- Effettuare ulteriori registrazioni di base 2−3 per assicurarsi che l'inserimento della cannula stessa non causi un cambiamento nel segnale evocato. In alcuni casi, l'inserimento e la rimozione della cannula interna può causare danni al VTA. Se il segnale cambia drasticamente in questo periodo di base (>20%), quindi effettuare ulteriori registrazioni 3-4 fino a quando la linea di base non si ristabilizza.
- Utilizzando una pompa a siringa e una microsiringa, infondere 0,5 μL di soluzione (ad esempio, 0,9% di soluzione salina, N-metil-D-aspartato [NMDA], (2R)-ammino-5-fosfonovalerico acido [AP5]) nel VTA per un periodo di 2 minuti.
- Dopo la concentrazione, lasciare la cannula interna per almeno 1 minuto prima della rimozione.
NOTA: Alcuni farmaci possono richiedere di lasciare la cannula interna per un tempo più lungo in base alla cinetica del farmaco, e la rimozione della cannula interna può causare il viaggio del farmaco indietro attraverso la cannula interna. Se c'è preoccupazione, si potrebbe lasciare la cannula interna nella cannula guida durante l'intera registrazione. In caso contrario, la registrazione può iniziare dopo questo intervallo di 1 minuto. - Continua a registrare ogni 3 minuti per misurare gli effetti post-infusione.
NOTA: se si infonde una soluzione di controllo e non si osserva alcun effetto, è possibile infondere una seconda volta10. Se c'è un rilascio alterato di DA causato dall'inserimento della cannula interna o dell'infusione salina, il segnale in genere si riprende al basale entro 30 minuti.
5. Verifica istologica del posizionamento dell'elettrodo
- Alla fine dell'esperimento, creare una piccola lesione nel sito di registrazione utilizzando il microelettrodo in fibra di carbonio.
- Se l'elettrodo deve essere conservato per la calibrazione post-esperimento, utilizzare un filo di tungsteno posto in un capillare di vetro sporgente ~ 100 μm oltre la punta capillare. In questo caso, sollevare l'elettrodo dal cervello, sostituire l'elettrodo di registrazione con l'elettrodo di tungsteno e abbassarlo alla stessa coordinata dorsoventrale.
NOTA: La fibra di carbonio può essere utilizzata anche per lesionare il cervello e fornirà una rappresentazione più accurata della posizione del sito di registrazione; tuttavia, lo sperimentatore perderà la capacità di calibrare questi elettrodi.
- Se l'elettrodo deve essere conservato per la calibrazione post-esperimento, utilizzare un filo di tungsteno posto in un capillare di vetro sporgente ~ 100 μm oltre la punta capillare. In questo caso, sollevare l'elettrodo dal cervello, sostituire l'elettrodo di registrazione con l'elettrodo di tungsteno e abbassarlo alla stessa coordinata dorsoventrale.
- Per lesionare il sito di registrazione, applicare tensione utilizzando un alimentatore. Iniziare a 1 V e aumentare di 1 V ogni 10 s fino a raggiungere 10 V.
- Eutanasia dell'animale con un'iniezione intraperitoneale letale di pentobarbital (150 mg/kg).
- Perfondere il ratto usando una soluzione di formalina al 4%.
- Rimuovere la testa dal topo usando una ghigliottina affilata.
- Usando rongeurs, rimuovere il tessuto connettivo e il cranio che circonda il cervello e rimuovere delicatamente il cervello da qualsiasi tessuto rimanente.
- Conservare il cervello in formalina al 4% per 1 giorno e quindi trasferirlo al 30% di saccarosio.
NOTA: La perfusione con formalina al 4% non è necessaria per vedere il sito della lesione, anche se come migliore pratica migliorerà la ricostruzione del sito della lesione. - Crea fette di cervello da 30 μm usando un criostato.
- Montare le fette su diapositive e coprire con un coperchio.
- Denotare la posizione della lesione del microelettrodo in fibra di carbonio e la posizione della cannula bipolare dello stimolatore / infusione utilizzando un microscopio ottico.
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Representative Results
CIS-FSCV è stato utilizzato per studiare la funzione dei recettori VTA N-metil-D-aspartato (NMDAR), dei recettori nicotinici dell'acetilcolina (nAChR) e dei recettori muscarinici dell'acetilcolina (mAChRs) nel guidare il rilascio di DA fasico nel nucleo NAc. La Figura 2 mostra i dati rappresentativi per un controllo negativo, infusione di soluzione salina allo 0,9%, prima (basale) e postinfusione di 9 minuti (soluzione salina). La Figura 2 mostra un grafico a colori con potenziale sull'asse y, tempo sull'asse x e corrente (rappresentata come falso colore) sull'asse z, tracce corrente contro tempo (IvT), nonché un voltammogramma ciclico preso al picco evocato risposta per dimostrare che l'analita misurato corrisponde a DA. Come previsto, l'infusione salina non ha alterato il rilascio di DA fasico stimolato.
Per dimostrare che CIS-FSCV può produrre effetti bidirezionali quando si usano agonisti e antagonisti, abbiamo confrontato gli effetti dell'infusione dell'agonista NMDAR, NMDA (500 ng; Figura 3A) all'antagonista NMDAR, AP5 (1 μg; Figura 3B). L'infusione di NMDA ha prodotto un robusto aumento del rilascio di DA fasica stimolata(Figura 3A,9 minuti dopo l'infusione) mentre l'antagonista competitivo NMDAR, AP5 (1 μg), ha prodotto una robusta diminuzione(Figura 3B,9 minuti dopo l'infusione). Per dimostrare l'utilità di CIS-FSCV utilizzando antagonisti che colpiscono diverse classi di recettori dell'acetilcolina, abbiamo confrontato gli effetti dell'infusione dell'antagonista nAChR non selettivo e non competitivo mecamylamine (3 μg; Figura 4A) e l'antagonista non selettivo e competitivo mAChR scopolamina (67 μg; Figura 4B). Entrambi i farmaci hanno prodotto robuste diminuzioni del rilascio di DA fasico stimolato(Figura 4,9 min postinfusione). Un riepilogo dei risultati della Figura 2, della Figura 3e della Figura 4 sono rappresentati nella Figura 5,dove il periodo basale è mediato su cinque stimolazioni e il periodo di farmaco viene visualizzato come percentuale della media basale.
Figura 1: Timeline per la registrazione prima e dopo la microinfusione VTA. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Colori rappresentativi e grafici IvT dell'infusione al basale (a sinistra) e salina (veicolo) (a destra) sul rilascio di DA fasico stimolato nel nucleo di NAc in un singolo ratto Sprague Dawley maschio. La barra blu rappresenta la stimolazione. La registrazione al basale avviene a t = 0, prima che la cannula interna fosse posizionata nella cannula guida nello stimolatore bipolare. La registrazione salina è stata effettuata 9 minuti (t = 9) post-infusione. Gli inserti ciclici del voltammogramma corrispondono al picco dei grafici IvT, mostrando un picco di ossidazione a 0,6 V e una riduzione di picco a -0,2 V, indicativo di DA. Nessun cambiamento nel rilascio evocato stimolato deve essere osservato dopo l'infusione salina di VTA. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Effetti dell'infusione dell'agonista NMDAR (NMDA) e dell'antagonista (AP5). (A) Colori rappresentativi e grafici IvT del basale (a sinistra) e 500 ng dell'infusione di agonisti NMDAR (a destra) sul rilascio di DA fasico stimolato nel nucleo NAc in un singolo ratto maschio di Sprague Dawley. L'infusione di NMDA ha aumentato il rilascio di DA fasico stimolato (registrazione effettuata 9 minuti dopo la trasfusione). (B) Colori rappresentativi e grafici IvT del basale (a sinistra) e 1 μg dell'antagonista NMDAR (2R)-ammino-5-fosfonovalerico (AP5) infusione (a destra) al rilascio stimolato di DA fasico nel nucleo di NAc in un singolo ratto maschio di Sprague Dawley. L'infusione di AP5 ha ridotto il rilascio di DA fasico stimolato (registrazione effettuata 9 minuti dopo la trasfusione). Le registrazioni al basale si sono verificate a t = 0, prima che la cannula interna fosse collocata nella cannula guida nello stimolatore bipolare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Effetti dell'infusione di mecamilammina e scopolamina. (A) Colori rappresentativi e grafici IvT del basale (a sinistra) e 3 μg dell'antagonista nicotinico non selettivo del recettore dell'acetilcolina mecamilamina (MEC) (a destra) al rilascio stimolato di DA fasico nel nucleo di NAc in un singolo ratto maschio di Sprague Dawley. (B) Colori rappresentativi e grafici IvT del basale (a sinistra) e 67 μg dell'antagonista muscarinico non selettivo del recettore dell'acetilcolina scopolamina (SCOP) infusione (a destra) al rilascio di DA fasico stimolato nel nucleo di NAc in un singolo ratto maschio di Sprague Dawley. La registrazione al basale si è verificata a t = 0, prima che la cannula interna fosse collocata nella cannula guida nello stimolatore bipolare. Le registrazioni MEC e SCOP sono state effettuate 9 minuti dopo la messa in onda. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Riepilogo dei dati che mostra gli effetti dei farmaci nel tempo. Il periodo pre-infusione (basale) è stato mediato su cinque stimolazioni e il periodo post-infusione (a partire da t = 3) è presentato come percentuale del basale. A 9 minuti dopo la trasfusione, abbiamo osservato che il segnale DA evocato era il 103% del basale dopo infusione salina, il 196% dopo infusione NMDA, il 18% dopo infusione AP5, il 49% dopo infusione MEC e il 43% dopo infusione SCOP. n = 1 per condizione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
CIS-FSCV offre un'opportunità unica per studiare i meccanismi del recettore VTA alla base del rilascio di DA fasico. Ci sono due passaggi critici per garantire una corretta registrazione. In primo luogo, è necessario ottenere una registrazione di base stabile, con poca deriva nel segnale DA evocato. Un modo importante per aumentare la probabilità di stabilire una registrazione stabile è assicurarsi che l'elettrodo abbia avuto tutto il tempo di pedalare sia a 60 Hz che a 10 Hz (in genere 15 minuti a 60 Hz e 10 minuti a 10 Hz). Mentre la fibra di carbonio viene riciclata, la fibra di carbonio stessa si ossida e viene incisa, diminuendo la superficie ma producendo nuova superficie per l'adsorbimento della dopamina23. Ciò può portare ad un aumento della sensibilità al DA. Pertanto, si potrebbe vedere un leggero aumento del rilascio di dopamina stimolato nel tempo nell'esperimento a causa di questa maggiore incisione, piuttosto che di qualsiasi manipolazione farmacologica. Inoltre, iniziare una registrazione entro 90-120 minuti dall'anestesia iniziale aumenterà la probabilità di una registrazione stabile per lunghi periodi di tempo. Pertanto, quando il ratto si avvicina alla morte per anestesia, è tipico che il rilascio di DA evocato diminuisca lentamente.
Il secondo passo critico in questa procedura è quello di garantire che la cannula di infusione venga inserita delicatamente nell'elettrodo stimolante bipolare. I braccioli stereotassici possono muoversi se viene posta troppa pressione durante l'inserimento della cannula interna e, di conseguenza, il segnale della dopamina potrebbe aumentare o diminuire artificialmente, poiché il sito di stimolazione potrebbe essere diverso. Se c'è un cambiamento significativo nel segnale evocato dopo l'inserimento della cannula, deve essere stabilito un nuovo periodo basale. Inoltre, se c'è un rilascio alterato di DA causato dall'inserimento della cannula interna o dell'infusione del veicolo, il segnale in genere si riprende al basale entro 30 minuti. In caso di alterazioni estese del rilascio di DA all'infusione del veicolo, la velocità o il volume di infusione potrebbero essere ridotti. Gli sperimentatori possono anche eseguire una registrazione aggiuntiva dopo aver inserito la cannula interna prima dell'infusione per valutare se l'inserimento della cannula stessa può alterare il rilascio. In relazione a ciò, è importante verificare che l'infusione si sia verificata e che non vi sia alcun blocco della cannula interna. Un modo per farlo è fare una piccola bolla nel tubo di infusione e contrassegnarla con una penna o un pennarello. La bolla deve essere più lontana dal marcatore dopo l'infusione. Un altro modo per garantire che l'infusione sia avvenuta correttamente è accendere la pompa per infusione dopo che la cannula interna è stata rimossa dal cervello e, se c'è ancora soluzione che si forma sulla punta, è probabile che si sia verificata un'infusione di successo.
CIS-FSCV può essere adattato per studiare i recettori VTA in animali sia naïve comportamentali che addestrati per studiare i cambiamenti nella funzione del recettore nel tempo11. CIS-FSCV può anche essere modificato per misurare 5-HT e noradrenalina (NE)24,25. CIS-FSCV è anche molto adatto per esperimenti di comportamento sveglio e può essere integrato con approcci optogenetici26,27. È importante notare che gli eventi di rilascio evocati elettricamente sono distinti dagli eventi di rilascio transitorio spesso osservati negli studi in movimento libero e meno spesso nella preparazione anestetizzata. Gli eventi di rilascio transitorio, ad esempio, potrebbero non essere necessariamente guidati dalla depolarizzazione diretta dei neuroni della dopamina a differenza degli eventi di rilascio evocati elettricamente28. Come tale, l'attività neurale fasica potrebbe essere dissociabile dagli eventi di rilascio di dopamina rilevati tramite FSCV. Inoltre, è stato dimostrato che il rilascio di DA evocato otticamente differisce dagli eventi di rilascio DA evocati elettricamente. Un recente confronto tra stimolazione evocata otticamente ed elettricamente ha rivelato che la stimolazione evocata elettricamente produce una regolazione multisinaptica del rilascio di DA fasico, mentre la stimolazione evocata otticamente può limitare la stimolazione a circuiti più specifici29.
Alcuni approcci recenti hanno impiegato metodi optogenetici e fluorescenti per studiare i circuiti alla base della dinamica rapida della dopamina in vivo30. Ad esempio, un recente lavoro di Sun e colleghi ha dimostrato che la stimolazione optogenetica dei neuroni della dopamina nella substantia nigra produce rapidi aumenti di DA nello striato, misurati tramite l'espressione di sensori DA (GRAB DA) basati su recettori accoppiati alla proteina G (GRABDA)30. Approcci optogenetici e di fluorescenza combinati potrebbero essere utilizzati per stimolare o inibire specifici input afferenti al VTA mentre si misura il rilascio di DA nel NAc. CIS-FSCV non può stimolare le afferenze in modo specifico come la stimolazione optogenetica, ma ha un vantaggio in quanto può affrontare domande sui recettori presinaptici e postsinaptici all'interno del VTA. Mentre entrambi gli approcci fluorescenti e FSCV hanno una risoluzione temporale sufficiente (subsecondo) e sensibilità al DA (1-10 nM) per misurare in modo comparabile i cambiamenti nel rilascio fasico di DA30,31, un vantaggio che FSCV può avere rispetto al monitoraggio fluorescente del DA fasico in vivo è che non sono necessarie manipolazioni genetiche per la registrazione. In effetti, un esperimento CIS-FSCV può essere completato in poche ore, mentre gli approcci optogenetici e di fluorescenza combinati richiedono tempo sufficiente (settimane) per un'espressione sufficiente utilizzando costrutti virali.
Un vantaggio chiave di CIS-FSCV è che la regolazione specifica del recettore VTA del rilascio di DA fasico può essere studiata nel cervello intatto, basandosi su altri studi in vivo che misurano le proprietà elettrofisiologiche dei neuroni VTA o studi in vitro che valutano la regolazione presinaptica del rilascio di DA fasico3,12. Un avvertimento di CIS-FSCV è che queste registrazioni devono essere fatte in un'area relativamente ricca di DA. Questo per due motivi: in primo luogo, ci sono alcuni limiti alla sensibilità FSCV, che può rilevare solo concentrazioni di DA nell'intervallo nanomolare e superiori a6,19. In secondo luogo, FSCV ha difficoltà a dissociare la noradrenalina da DA, perché i loro voltammogrammi ciclici sono quasi identici. Pertanto, questi studi possono essere limitati alla valutazione di aree con DA elevato, come alcune parti della corteccia prefrontale mediale, NAc, striato e tubercolo olfattivo32. Studi futuri potrebbero essere in grado di impiegare alcuni dei progressi degli approcci FSCV che consentono una migliore discriminazione tra DA e NE, così come altri neurotrasmettitori elettroattivi come l'adenosina33 e la serotonina12.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Il lavoro è stato sostenuto dall'Elizabethtown College (R.J.W, M.L. e L.M.), da una NSF Graduate Fellowship (R.J.W.) e dalla Yale School of Medicine (N.A.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electrode Filling Solution/Supplies | |||
| Micropipette | World Precision Instruments | MF286-5 (28 gauge) | |
| Potassium Acetate | Sigma | 236497-100G | |
| Potassium Chloride | Sigma | P3911-25G | |
| Electrode Supplies | |||
| Carbon fiber | Thornel | T650 | |
| Electrode puller | Narishige International | PE-22 | Note: horizontal pullers can be used as well |
| Glass capillary | A-M systems | 626000 | |
| Insulated wires for electrodes | Weico Wire and Cable Incorporated | UL 1423 | Length; 10 cm; diameter,0.4mm; must get custom made; insulated material should cover 5 cm of the wire |
| Light Microscope (for viewing and cutting electrode) | Fischer Scientific | M3700 | |
| Pin | Phoenix Enterprises | HWS1646 | To be soldered onto the insuled electrode wire and reference electrode; connects to headstage |
| Putty | Alcolin | 23922-1003 | Used to place electrode on while cutting the carbon fiber |
| Scalpal Blade | World Precision Instruments | 500239 | For cutting carbon fiber to the apprpriate length |
| Silver Wire | Sigma | 327026-4G | |
| FSCV Hardware/Software | |||
| Faraday Cage | U-Line | H-3618 (36" x 24" x 42") | |
| Potentiostat | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | ||
| Stimulating electrode | PlasticsOne | MS303/2-A/SPC | when ordering, request a 22 mm cut below pedestal |
| TarHeel HDCV Software | University of North Carolina-Chapel Hill | - | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information |
| UEI breakout box | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information | |
| UEI power supply | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information | |
| Stimulator Hardware | |||
| Neurolog stimulus isolator | Digitimer Ltd. | DS4 | Neurolog 800A |
| Infusion/Stimulation Supplies | |||
| Infusion Pump | New Era Syringe Pump | NE-300 | |
| Internal Cannula | PlasticsOne | C315I/SPC INTERNAL 33GA | |
| Microliter Syringe | Hamilton | 80308 | |
| Tubing | PlasticsOne | C313CT/ PKG TUBING 023 X 050 PE50 | |
| Surgical Supplies | |||
| Cannula Holder | Kopf Instruments | 1776 P-1 | |
| Cotton Tip Applicators | Vitality Medical | 806 | |
| Electrode Holder | Kopf Instruments | 1770 | |
| Heating Pad | Kent Scientific | RT-0501 | |
| Povidone Iodine | Vitality Medical | 29906-004 | |
| Screws | Stoelting | Bone Anchor Screws/Pkg.of 100 | 1.59 mm O.D., 3.2 mm long |
| Silver wire reference with AgCl | InVivo Metric | E255A | |
| Square Gauze | Vitality Medical | 441408 | |
| Stereotax | Kopf Instruments | Model 902 (Dual Arm Bar) | |
| Histological Supplies | |||
| Formulin | Sigma | 1004960700 | |
| Power supply | BK Precision | 9110 | |
| Sucrose | Sigma | 80497 | |
| Tungsten microelectrode | MicroProbes | WE30030.5A3 | |
| Drugs for infusions | |||
| ((2R)-amino-5-phosphonovaleric acid | Sigma Aldrich | A5282 | |
| N-methyl-D-aspartate | Sigma Aldrich | M3262 | |
| Mecamylamine hydrochloride (M9020-5mg) | Sigma Aldrich | M9020 | |
| Scopolamine hydrobromide (S0929-1g) | Sigma Aldrich | S0929 |
References
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