Kombinierte Infusion und Stimulation mit zyklischer Fast-Scan-Voltammetrie (CIS-FSCV) zur Beurteilung der ventralen Tegmental-Area-Rezeptor-Regulation von phasischem Dopamin
Summary
Das Ziel dieses Protokolls ist es, ventrale tegmentale Bereichsrezeptoren direkt zu manipulieren, um ihren Beitrag zur Subsekunden-Dopaminfreisetzung zu untersuchen.
Abstract
Die phasische Dopaminausschüttung (DA) aus dem ventralen tegmentalen Bereich (VTA) in den Nucleus accumbens spielt eine zentrale Rolle bei der Belohnungsverarbeitung und beim reinforcementden Lernen. Zu verstehen, wie die verschiedenen neuronalen Eingaben in die phasische DA-Freisetzung der VTA-Kontrolle ein besseres Bild der Schaltkreise liefern können, die die Belohnungsverarbeitung und das Verstärkungslernen steuern. Hier beschreiben wir eine Methode, die Intra-VTA-Kanüleninfusionen von pharmakologischen Agonisten und Antagonisten mit stimulationshergerufener phasischer DA-Freisetzung (kombinierte Infusion und Stimulation oder CIS) kombiniert, gemessen durch in vivo zyklische Schnellscan-Voltammetrie (FSCV). Unter Verwendung von CIS-FSCV bei anästhesierten Ratten kann eine phasische DA-Reaktion hervorgerufen werden, indem die VTA mit einer bipolaren Elektrode, die mit einer Kanüle versehen ist, während im Kern des Nucleus accumbens elektrisch stimuliert wird. Pharmakologische Agonisten oder Antagonisten können direkt an der Stimulationsstelle infundiert werden, um die Rolle spezifischer VTA-Rezeptoren bei der Förderung der phasischen DA-Freisetzung zu untersuchen. Ein großer Vorteil von CIS-FSCV besteht darin, dass die VTA-Rezeptorfunktion in vivo untersucht werden kann, aufbauend auf In-vitro-Studien.
Introduction
Die freisetzung von phasischem Dopamin (DA) aus dem ventralen tegmentalen Bereich (VTA) in den Nucleus accumbens (NAc) spielt eine wichtige Rolle bei belohnungsbezogenen Verhaltensweisen. VTA DA-Neuronen wechseln von einem tonischartigen Feuer (3-8 Hz) zu einem Burst-ähnlichen Feuer (>14 Hz)1, was eine phasische DA-Freisetzung im NAc erzeugt. Der VTA exprimiert eine Vielzahl von somatodendritischen Rezeptoren, die gut positioniert sind, um den Wechsel von tonisch zu burstfeuern2,3,4,5zusteuern. Die Identifizierung, welcher dieser Rezeptoren und ihre jeweiligen Eingaben die phasische DA-Freisetzung steuern, wird unser Verständnis dafür vertiefen, wie die belohnungsbezogene Schaltung organisiert ist. Der Zweck der hier beschriebenen Methodik, kombinierte Infusion und Stimulation mit zyklischer Schnellscan-Voltammetrie (CIS-FSCV), besteht darin, die Funktionalität von VTA-Rezeptoren bei der Förderung der phasischen DA-Freisetzung schnell und robust zu bewerten.
Der Begriff kombinierte Infusion und Stimulation (CIS) bezieht sich auf die pharmakologische Manipulation von Rezeptoren auf einer Gruppe von Neuronen (hier die VTA) und die Stimulierung dieser Neuronen, um die Funktion des Rezeptors zu untersuchen. Bei der betäubten Ratte stimulieren wir die VTA elektrisch, um ein großes phasisches DA-Signal (1-2 μM) im NAc-Kern hervorzurufen, gemessen durch zyklische Schnellscan-Voltammetrie (FSCV). Infusionen von pharmakologischen Medikamenten (d.h. Rezeptoragonisten/-antagonisten) an der Stimulationsstelle können verwendet werden, um die Funktion von VTA-Rezeptoren zu messen, indem die nachfolgende Veränderung der evozierten phasischen DA-Freisetzung beobachtet wird. FSCV ist ein elektrochemischer Ansatz, der sowohl eine hohe räumliche (50-100 μm) als auch eine zeitliche (10 Hz) Auflösung aufweist und sich gut für die Messung belohnungsbezogener, phasischer DA-Ereignisseeignet 6,7. Diese Auflösung ist feiner als andere neurochemische In-vivo-Messungen, wie z.B. Mikrodialyse. Daher ist CIS-FSCV zusammen gut geeignet, um die VTA-Rezeptorregulation der phasischen Dopaminfreisetzung zu beurteilen.
Eine gängige Methode zur Untersuchung der VTA-Rezeptorfunktion ist die Verwendung einer Kombination elektrophysiologischer Ansätze, die untersuchen, wie diese Rezeptoren die Feuerrate von Neuronen verändern1,8. Diese Studien sind sehr wertvoll, um zu verstehen, welche Rezeptoren daran beteiligt sind, DA bei Aktivierung anzutreiben. Diese Studien können jedoch nur darauf hindeuten, was stromabwärts am Axonterminal passieren könnte (d. H. Freisetzung eines Neurotransmitters). CIS-FSCV baut auf diesen elektrophysiologischen Studien auf, indem es beantwortet, wie die Ausgabe von VTA-Burst-Feuerung, phasischer DA-Freisetzung, durch Rezeptoren reguliert wird, die sich auf VTA-Dendriten und Zellkörpern befinden. Cis-FSCV ist daher gut geeignet, um auf diesen elektrophysiologischen Studien aufzubauen. Als Beispiel kann die Nikotinrezeptoraktivierung das Burst-Feuern im VTA9induzieren, und CIS-FSCV in der anästhesierten Ratte wurde verwendet, um zu zeigen, dass die Aktivierung des nikotinischen Acetylcholinrezeptors (nAChR) in der VTA auch die phasische DA-Freisetzung im NAc10steuert,11.
Die mechanistische Untersuchung der phasischen DA-Regulation wird auch häufig mit Slice-Präparaten zusammen mit der Anwendung von Medikamenten untersucht. Diese Studien konzentrieren sich oft auf die präsynaptische Regulation der phasischen DA-Freisetzung von Dopaminterminalen, da die Zellkörper oft aus derScheibe 12entfernt werden. Diese Präparate sind wertvoll für die Untersuchung präsynaptischer Rezeptorwirkungen auf Dopaminterminale, während CIS-FSCV besser geeignet ist, um somatodendritische Rezeptorwirkungen auf Dopaminneuronen sowie präsynaptische Inputs in die VTA zu untersuchen. Diese Unterscheidung ist wichtig, da die Aktivierung des somatodendritischen Rezeptors im VTA einen anderen Effekt haben kann als die Aktivierung des präsynaptischen NAc-Rezeptors. Tatsächlich kann die Blockierung dopaminerger präsynaptischer nAChRs im NAc die phasische Dopaminfreisetzung während des Burst-Firings13erhöhen, während das Gegenteil bei VTA somatodendritc nAChRs10,11der Fall ist.
CIS-FSCV ist ein idealer Ansatz, um die Fähigkeit von VTA-Rezeptoren zu untersuchen, die phasische DA-Freisetzung zu regulieren. Wichtig ist, dass dieser Ansatz bei einer intakten Ratte durchgeführt werden kann, entweder betäubt oder sich frei bewegend. Dieser Ansatz eignet sich für akute Studien, zur Untersuchung der Rezeptorfunktion im Ausgangszustand10,14 sowie für Langzeitstudien, die funktionelle Veränderungen in einem Rezeptor nach Arzneimittelexposition oder Verhaltensmanipulation beurteilen können11,15.
Protocol
Representative Results
Discussion
CIS-FSCV bietet eine einzigartige Gelegenheit, die VTA-Rezeptormechanismen zu untersuchen, die der phasischen DA-Freisetzung zugrunde liegen. Es gibt zwei kritische Schritte, um eine ordnungsgemäße Aufzeichnung zu gewährleisten. Zunächst muss eine stabile Baseline-Aufzeichnung erreicht werden, mit wenig Drift im evozierten DA-Signal. Eine wichtige Möglichkeit, die Wahrscheinlichkeit einer stabilen Aufzeichnung zu erhöhen, besteht darin, sicherzustellen, dass die Elektrode genügend Zeit hatte, sowohl bei 60 Hz als …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Arbeit wurde vom Elizabethtown College (R.J.W., M.L. und L.M.), durch ein NSF Graduate Fellowship (R.J.W.) und von der Yale School of Medicine (N.A.) unterstützt.
Materials
| Electrode Filling Solution/Supplies | |||
| Micropipette | World Precision Instruments | MF286-5 (28 gauge) | |
| Potassium Acetate | Sigma | 236497-100G | |
| Potassium Chloride | Sigma | P3911-25G | |
| Electrode Supplies | |||
| Carbon fiber | Thornel | T650 | |
| Electrode puller | Narishige International | PE-22 | Note: horizontal pullers can be used as well |
| Glass capillary | A-M systems | 626000 | |
| Insulated wires for electrodes | Weico Wire and Cable Incorporated | UL 1423 | Length; 10 cm; diameter,0.4mm; must get custom made; insulated material should cover 5 cm of the wire |
| Light Microscope (for viewing and cutting electrode) | Fischer Scientific | M3700 | |
| Pin | Phoenix Enterprises | HWS1646 | To be soldered onto the insuled electrode wire and reference electrode; connects to headstage |
| Putty | Alcolin | 23922-1003 | Used to place electrode on while cutting the carbon fiber |
| Scalpal Blade | World Precision Instruments | 500239 | For cutting carbon fiber to the apprpriate length |
| Silver Wire | Sigma | 327026-4G | |
| FSCV Hardware/Software | |||
| Faraday Cage | U-Line | H-3618 (36" x 24" x 42") | |
| Potentiostat | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | ||
| Stimulating electrode | PlasticsOne | MS303/2-A/SPC | when ordering, request a 22 mm cut below pedestal |
| TarHeel HDCV Software | University of North Carolina-Chapel Hill | – | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information |
| UEI breakout box | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information | |
| UEI power supply | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information | |
| Stimulator Hardware | |||
| Neurolog stimulus isolator | Digitimer Ltd. | DS4 | Neurolog 800A |
| Infusion/Stimulation Supplies | |||
| Infusion Pump | New Era Syringe Pump | NE-300 | |
| Internal Cannula | PlasticsOne | C315I/SPC INTERNAL 33GA | |
| Microliter Syringe | Hamilton | 80308 | |
| Tubing | PlasticsOne | C313CT/ PKG TUBING 023 X 050 PE50 | |
| Surgical Supplies | |||
| Cannula Holder | Kopf Instruments | 1776 P-1 | |
| Cotton Tip Applicators | Vitality Medical | 806 | |
| Electrode Holder | Kopf Instruments | 1770 | |
| Heating Pad | Kent Scientific | RT-0501 | |
| Povidone Iodine | Vitality Medical | 29906-004 | |
| Screws | Stoelting | Bone Anchor Screws/Pkg.of 100 | 1.59 mm O.D., 3.2 mm long |
| Silver wire reference with AgCl | InVivo Metric | E255A | |
| Square Gauze | Vitality Medical | 441408 | |
| Stereotax | Kopf Instruments | Model 902 (Dual Arm Bar) | |
| Histological Supplies | |||
| Formulin | Sigma | 1004960700 | |
| Power supply | BK Precision | 9110 | |
| Sucrose | Sigma | 80497 | |
| Tungsten microelectrode | MicroProbes | WE30030.5A3 | |
| Drugs for infusions | |||
| ((2R)-amino-5-phosphonovaleric acid | Sigma Aldrich | A5282 | |
| N-methyl-D-aspartate | Sigma Aldrich | M3262 | |
| Mecamylamine hydrochloride (M9020-5mg) | Sigma Aldrich | M9020 | |
| Scopolamine hydrobromide (S0929-1g) | Sigma Aldrich | S0929 |
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