生理条件下猪心的切片和培育
Summary
该协议描述了如何在生理条件下切片和培养心脏组织6天。该培养系统可用作测试新型心力衰竭治疗效果的平台，以及3D心脏模型中急性心毒性的可靠检测平台。
Abstract
许多新药在临床研究中失败，由于心毒副作用，因为目前可用的体外测定和体内动物模型对人体心脏负债的预测不佳，给制药业带来了数十亿美元的负担。因此，全世界在进行昂贵且耗时的”人类第一”试验之前，需要更好的方法来识别药物心毒性， 在全球范围内未得到满足。目前，只有未成熟的心脏细胞（人类诱导多能干细胞衍生心肌细胞[hiPSC-CMs]）用于测试治疗效率和药物毒性，因为它们是唯一可以长期培养的人类心脏细胞需要测试药物疗效和毒性。然而，单个细胞类型不能复制由多种细胞类型组成的复杂3D心脏组织表型。重要的是，药物对成人心肌细胞的影响需要测试，与不成熟的hiPSC-CMs相比，其特征和毒性反应不同。 培养人类心脏切片是完整人体心肌的一种有前途的模式。该技术提供一个完整的多细胞系统，模拟人类心脏组织，反映人类心肌的生理或病理状况。最近，通过优化培养介质组件和培养条件，包括1.2 Hz的连续电刺激和培养介质的间歇性氧合，我们开发了一种新的培养系统设置，以保持生存能力和功能的人和猪心脏切片6天的培养。在目前的协议中，我们以研究猪心切片和培养的方法为例。同样的协议用于培养来自人类、狗、绵羊或猫心的切片。该培养系统有可能成为急性心毒性检测的强有力的预测性人类原位模型，从而缩小临床前和临床检测结果之间的差距。
Introduction
药物诱发的心肌毒性是市场退出的主要原因1.在20世纪的最后十年里，有8种非心血管药物因心室心律失常导致突然死亡而退出市场。此外，几种抗癌疗法（在许多情况下有效）可导致多种心毒性作用，包括心肌病和心律失常。例如，传统（如安曲霉素和辐射）和靶向（如曲图祖马布）乳腺癌疗法都可能导致患者的一部分3的心血管并发症。心脏病学家和肿瘤学家之间的密切合作（通过新兴的”心肿瘤”领域）帮助使这些并发症易于管理，确保患者得到有效治疗。较新的药物，包括Her2和PI3K抑制剂的心血管效应不太清楚，尤其是当疗法被结合使用时。因此，在人体临床试验之前，人们越来越需要可靠的心血管毒性临床前筛查策略， 与新兴的抗癌疗法有关。人体心脏组织缺乏在功能上和结构上可存活超过24小时的培养系统，是可靠的心毒性测试的一个限制因素。因此，迫切需要开发一个可靠的系统，在生理条件下培养人类心脏组织，以测试药物毒性。
最近，人类诱导多能干细胞衍生心肌细胞（hiPSC-CMs）在心毒性测试中的使用，为解决这一问题提供了部分解决办法;然而，与心脏组织的多细胞性质相比，hiPSC-CM的不成熟性质和组织完整性的丧失是该技术的主要局限性4。最近的一项研究通过从水凝胶上制造hiPSC-CM的心脏组织，并使它们随着时间的推移逐渐增加电刺激，从而部分克服了这种限制。然而，它们的机电性能并没有达到成人心肌的成熟度。此外，心脏组织在结构上更为复杂，由各种细胞类型组成，包括内皮细胞、神经元和各种类型的基质纤维细胞，与细胞外基质蛋白6的非常特殊的混合物连接在一起。这种非心肌细胞群的异质性在成年哺乳动物,8,心脏中为使用单个细胞类型对心脏组织进行建模的主要障碍。这些主要限制强调开发方法的重要性，使完整的心脏组织培养，以最佳研究涉及心脏的生理和病理条件5。
培养人类心脏切片是一种完整的人类心肌的有前途的模型。该技术提供了获得一个完整的3D多细胞系统，类似于人类心脏组织，可以可靠地反映人类心肌的生理或病理状况。然而，它的使用受到文化生存时间短的严格限制，在2018年10、11、12,11,12之前，使用报告的最可靠的协议不会超过24小时。这一限制是由于多种因素造成的，包括使用空气-液体接口来培养切片，以及使用一种不支持心脏组织高能量需求的简单培养介质。我们最近开发了一个水下培养系统，能够提供连续的电刺激和优化培养培养培养成分，以保持心脏组织切片的活性长达6天13。该培养系统有可能成为急性心毒性检测的强有力的预测性人类原位模型，以缩小临床前和临床检测结果之间的差距。在本文中，我们将详细介绍使用猪心切片来切片和培养的规程。同样的过程也适用于人类、狗、绵羊或猫的心脏。有了这个协议，我们希望将这项技术推广到科学界的其他实验室。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这里，我们描述了我们最近发布的简化中等通量方法的详细视频协议（过程多达48片/设备），使猪心切片的培养时间足够长，以测试急性心毒性13。建议的条件模仿心脏的环境，包括电刺激的频率、营养供应和间歇性氧合。我们将生物仿生刺激培养中心片的长期生存能力归因于我们专注于重建完整心脏所经历的生理状况。这一概念得到我们的数据的支持，表明仅靠电刺激而不?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
TMAM 得到 NIH 授予 P30GM127607 和美国心脏协会授予 16SDG29950012 的支持。RB 支持 P01HL78825 和 UM1HL113530。
Materials
| 1000ml, 0.22µm, Vacuum Filter/Storage Systems | VWR | 28199-812 | |
| 2,3-Butanedione monoxime (BDM) | Fisher | AC150375000 | |
| 500ml, 0.22µm, Vacuum Filter/Storage Systems | VWR | 28199-788 | |
| 6-well C-Dish Cover (electrical-stimulation-plate-cover) | Ion Optix | CLD6WFC | |
| 6-well plates | Fisher | 08-772-1B | |
| Agarose | Bioline USA | BIO-41025 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo | 15-240-062 | |
| C-Pace EM (cell-culture-electrical-stimulator) | Ion Optix | CEP100 | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Fisher | C79-500 | |
| Ceramic Blades for Vibrating Microtome | Campden Instruments | 7550-1-C | |
| Cooley Chest Retractor | Millennium Surgical | 63-G5623 | |
| D-Glucose | Fisher | D16-1 | |
| Disposable Scalpel #20 | Biologyproducts.com | DS20X | |
| Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning | VWR | 21008-952 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo | A3160502 | |
| Graefe Forceps | Fisher | NC9475675 | |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Histoacryl BLUE Tissue glue | Amazon | https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/ | |
| Iris Spring scissors | Fisher | NC9019530 | |
| Iris Straight Scissors | Fisher | 731210 | |
| Isoflurane, USP | Piramal | NDC 66794-017-25 | |
| ITS Liquid Media Supplement | Sigma-Aldrich | I3146-5ML | |
| Ketamine HCl (500 mg/10 mL) | West-Ward | NDC 0143-9508 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Fisher | M33-500 | |
| Mayo SuperCut Surgical Scissors | AROSurgical Instruments Corporation | AROSuperCut™ 07.164.17 | |
| Medium 199, Earle's Salts | Thermo | 11-150-059 | |
| Oxygen regulator | Praxair | ||
| Oxygen tanks – | Praxair | ||
| Plastic Pasteur pipettes | Fisher | 13-711-48 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher | AC193780010 | |
| Printer Timing Belt | Amazon | https://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/ | |
| Razor rectangle blades | Fisher | 12-640 | |
| Recombinant Human FGF basic | R&D Systems | 233-FB-025/CF | |
| Recombinant Human VEGF | R&D Systems | 293-VE-010/CF | |
| Retractable scalpels | Fisher | 22-079-716 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher | AC217125000 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | AC327300010 | |
| Vibrating Microtome | Campden Instruments | 7000 SMZ-2 | |
| Xylazine HCl (100 mg/mL) | Heartland Veterinary Supply | NADA 139-236 |
References
- Onakpoya, I. J., Heneghan, C. J., Aronson, J. K. Post-marketing withdrawal of 462 medicinal products because of adverse drug reactions: a systematic review of the world literature. BMC Medicine. 14, 10 (2016).
- Fermini, B., Fossa, A. A. The impact of drug-induced QT interval prolongation on drug discovery and development. Nature Reviews Drug Discovery. 2 (6), 439-447 (2003).
- Moslehi, J. J. Cardiovascular Toxic Effects of Targeted Cancer Therapies. The New England Journal of Medicine. 375 (15), 1457-1467 (2016).
- Robertson, C., Tran, D. D., George, S. C. Concise review: maturation phases of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells. 31 (5), 829-837 (2013).
- Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
- Pinto, A. R., et al. Revisiting Cardiac Cellular Composition. Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).
- Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260 (2016).
- Fu, X., et al. Specialized fibroblast differentiated states underlie scar formation in the infarcted mouse heart. Journal of Clinical Investigations. 128 (5), 2127-2143 (2018).
- Kretzschmar, K., et al. Profiling proliferative cells and their progeny in damaged murine hearts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (52), E12245-E12254 (2018).
- Perbellini, F., et al. Investigation of cardiac fibroblasts using myocardial slices. Cardiovascular Research. 114 (1), 77-89 (2018).
- Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).
- Kang, C., et al. Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials. Scientific Reports. 6, 28798 (2016).
- Ou, Q., et al. Physiological Biomimetic Culture System for Pig and Human Heart Slices. Circulation Research. 125 (6), 628-642 (2019).
- Jones, S. P., et al. The NHLBI-sponsored Consortium for preclinicAl assESsment of cARdioprotective therapies (CAESAR): a new paradigm for rigorous, accurate, and reproducible evaluation of putative infarct-sparing interventions in mice, rabbits, and pigs. Circulation Research. 116 (4), 572-586 (2015).
- Crick, S. J., Sheppard, M. N., Ho, S. Y., Gebstein, L., Anderson, R. H. Anatomy of the pig heart: comparisons with normal human cardiac structure. Journal of Anatomy. 193 (Pt 1), 105-119 (1998).
- Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10 (1), 117 (2019).
- Franke, J., Abs, V., Zizzadoro, C., Abraham, G. Comparative study of the effects of fetal bovine serum versus horse serum on growth and differentiation of primary equine bronchial fibroblasts. BMC Veterinary Research. 10, 119 (2014).
- Vuorenpaa, H., et al. Novel in vitro cardiovascular constructs composed of vascular-like networks and cardiomyocytes. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 50 (4), 275-286 (2014).
- Qiao, Y., et al. Multiparametric slice culture platform for the investigation of human cardiac tissue physiology. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 144, 139-150 (2018).
- Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10 (1), 2168 (2019).
