Schneiden und Culieren von Schweineherzen unter physiologischen Bedingungen
Summary
Dieses Protokoll beschreibt, wie herzgewebe unter physiologischen Bedingungen für 6 Tage geschnitten und kultiviert werden kann. Dieses Kultursystem könnte als Plattform für die Prüfung der Wirksamkeit neuartiger Herzinsuffizienz-Therapeutika sowie als zuverlässige Spross enderatonie Tests der akuten Kardiotoxizität in einem 3D-Herzmodell verwendet werden.
Abstract
Viele neuartige Medikamente scheitern in klinischen Studien an kardiotoxischen Nebenwirkungen, da die derzeit verfügbaren In-vitro-Assays und In-vivo-Tiermodelle die menschlichen Herzverbindlichkeiten schlecht vorhersagen, was eine milliardenschwere Belastung für die pharmazeutische Industrie darstellt. Daher besteht weltweit ein weltweit unerfüllter medizinischer Bedarf an besseren Ansätzen zur Identifizierung der Kardiotoxizität von Arzneimitteln, bevor kostspielige und zeitaufwändige “First in Man”-Studien durchgeführt werden. Derzeit werden nur unreife Herzzellen (menschliche induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten [hiPSC-CMs]) verwendet, um die therapeutische Effizienz und Arzneimitteltoxizität zu testen, da sie die einzigen menschlichen Herzzellen sind, die über einen längeren Zeitraum kultiviert werden können. Arzneimittelwirksamkeit und Toxizität zu testen. Ein einzelner Zelltyp kann jedoch nicht den Phänotyp des komplexen 3D-Herzgewebes replizieren, das aus mehreren Zelltypen besteht. Wichtig ist, dass die Wirkung von Medikamenten an erwachsenen Kardiomyozyten getestet werden muss, die im Vergleich zu unreifen hiPSC-CMs unterschiedliche Eigenschaften und Toxizitätsreaktionen aufweisen. Diese Technologie bietet Zugang zu einem kompletten multizellulären System, das das menschliche Herzgewebe imitiert und die physiologischen oder pathologischen Bedingungen des menschlichen Myokards widerspiegelt. Kürzlich haben wir durch die Optimierung der Kulturmedienkomponenten und der Kulturbedingungen, um eine kontinuierliche elektrische Stimulation bei 1,2 Hz und die intermittierende Sauerstoffversorgung des Kulturmediums einzubeziehen, ein neues Kultursystem-Setup entwickelt, das die Lebensfähigkeit bewahrt. und Funktionalität von Menschen- und Schweineherzscheiben für 6 Tage in der Kultur. Im aktuellen Protokoll beschreiben wir als Beispiel die Methode zum Schneiden und Kultivieren von Schweineherzen. Das gleiche Protokoll wird verwendet, um Scheiben von Menschen-, Hunde-, Schaf- oder Katzenherzen zu kultiieren. Dieses Kultursystem hat das Potenzial, ein leistungsfähiges, vorausschauendes menschliches In-situ-Modell für akute Kardiotoxizitätstests zu werden, das die Lücke zwischen präklinischen und klinischen Testergebnissen schließt.
Introduction
Drogeninduzierte Kardiotoxizität ist eine Hauptursache für Marktentzug1. Im letzten Jahrzehnt des20. Jahrhunderts wurden acht nicht-kardiovaskuläre Medikamente vom Markt genommen, da sie zu einem plötzlichen Tod aufgrund ventrikulärer Arrhythmienführten 2. Darüber hinaus können mehrere Anti-Krebs-Therapien (während in vielen Fällen wirksam) zu mehreren kardiotoxischen Wirkungen führen, einschließlich Kardiomyopathie und Arrhythmien. Beispielsweise können sowohl traditionelle (z. B. Anthracycline und Strahlung) als auch gezielte (z. B. Trastuzumab) Brustkrebstherapien bei einer Teilmenge von Patienten zu kardiovaskulären Komplikationen führen3. Eine enge Zusammenarbeit zwischen Kardiologen und Onkologen (über das entstehende Feld der “Kardio-Onkologie”) hat dazu beigetragen, dass diese Komplikationen überschaubar sind, um sicherzustellen, dass Patienten effektiv behandelt werden können2. Weniger klar sind die kardiovaskulären Wirkungen neuerer Wirkstoffe, einschließlich Her2- und PI3K-Inhibitoren, insbesondere wenn Therapien in Kombination eingesetzt werden. Daher besteht ein wachsender Bedarf an zuverlässigen präklinischen Screening-Strategien für kardiovaskuläre Toxizitäten im Zusammenhang mit aufkommenden Krebstherapien vor klinischen Studien am Menschen. Die mangelnde Verfügbarkeit von Kultursystemen für menschliches Herzgewebe, das für mehr als 24 h funktionell und strukturell tragfähig ist, ist ein begrenzender Faktor für zuverlässige Kardiotoxizitätstests. Daher ist es dringend notwendig, ein zuverlässiges System zur Kultivierung menschlichen Herzgewebes unter physiologischen Bedingungen für die Prüfung der Arzneimitteltoxizität zu entwickeln.
Der jüngste Schritt hin zur Verwendung von humaninduzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten (hiPSC-CMs) in Kardiotoxizitätstests hat eine partielle Lösung zur Lösung dieses Problems geliefert; jedoch sind die Unreife Natur der hiPSC-CMs und der Verlust der Gewebeintegrität im Vergleich zur mehrzelligen Natur des Herzgewebes wesentliche Einschränkungen dieser Technologie4. Eine aktuelle Studie hat diese Einschränkung teilweise überwunden, indem herzgewebe von hiPSC-CMs auf Hydrogelen hergestellt und sie im Laufe der Zeit einer allmählichen Zunahme der elektrischen Stimulation ausgesetzt wurden5. Ihre elektromechanischen Eigenschaften erreichten jedoch nicht die Reife, die im erwachsenen menschlichen Myokard beobachtet wurde. Darüber hinaus ist das Herzgewebe strukturell komplizierter, da es aus verschiedenen Zelltypen besteht, darunter Endothelzellen, Neuronen und verschiedene Arten von stromalen Fibroblasten, die mit einer sehr spezifischen Mischung von extrazellulären Matrixproteinen verbunden sind6. Diese Heterogenität der Nicht-Kardiomyozyten-Zellpopulation7,8,9 im erwachsenen Säugetierherz ist ein großes Hindernis bei der Modellierung von Herzgewebe mit einzelnen Zelltypen. Diese großen Einschränkungen unterstreichen die Bedeutung der Entwicklung von Methoden, um kultur des intakten Herzgewebes für optimale Studien mit physiologischen und pathologischen Bedingungen des Herzens zu ermöglichen5.
Das Kultivieren menschlicher Herzscheiben ist ein vielversprechendes Modell für intaktes menschliches Myokard. Diese Technologie bietet Zugang zu einem kompletten 3D-Multizellularsystem, das dem menschlichen Herzgewebe ähnelt und die physiologischen oder pathologischen Bedingungen des menschlichen Myokards zuverlässig widerspiegeln könnte. Jedoch, seine Verwendung wurde stark durch die kurze Zeit der Lebensfähigkeit in der Kultur begrenzt, die nicht über 24 h mit den robustesten Protokollen bis 2018berichtet 10,11,12. Diese Einschränkung war auf mehrere Faktoren zurückzuführen, einschließlich der Verwendung von Luft-Flüssig-Schnittstelle, um die Scheiben zu kulturieren, und die Verwendung eines einfachen Kulturmediums, das die hohen energetischen Anforderungen des Herzgewebes nicht unterstützt. Wir haben vor kurzem ein Unterwasserkultursystem entwickelt, das in der Lage ist, kontinuierliche elektrische Stimulation zu bieten und die Kulturmedienkomponenten optimiert, um Herzgewebescheiben lebensfähig für bis zu 6 Tage13zu halten. Dieses Kultursystem hat das Potenzial, ein leistungsfähiges, vorausschauendes menschliches In-situ-Modell für akute Kardiotoxizitätstests zu werden, um die Lücke zwischen präklinischen und klinischen Testergebnissen zu schließen. Im aktuellen Artikel beschreiben wir das Protokoll zum Schneiden und Kultivieren der Herzscheiben am Beispiel eines Schweineherzens. Das gleiche Verfahren wird auf Menschen-, Hunde-, Schaf- oder Katzenherzen angewendet. Mit diesem Protokoll hoffen wir, die Technologie auf andere Laboratorien in der wissenschaftlichen Gemeinschaft zu verbreiten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschreiben wir das detaillierte Videoprotokoll für unsere kürzlich veröffentlichte Methode für vereinfachten Mittleren Durchsatz (Prozesse bis zu 48 Slices/Gerät), die die Kultur von Schweineherzscheiben für einen Zeitraum ermöglicht, der ausreichend lang ist, um die akute Kardiotoxizität zu testen13. Die vorgeschlagenen Bedingungen imitieren die Umgebung des Herzens, einschließlich der Häufigkeit der elektrischen Stimulation, der Verfügbarkeit von Nährstoffen und der intermittie…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
TMAM wird durch den NIH-Zuschuss P30GM127607 und den Zuschuss der American Heart Association 16SDG29950012 unterstützt. RB wird von P01HL78825 und UM1HL113530 unterstützt.
Materials
| 1000ml, 0.22µm, Vacuum Filter/Storage Systems | VWR | 28199-812 | |
| 2,3-Butanedione monoxime (BDM) | Fisher | AC150375000 | |
| 500ml, 0.22µm, Vacuum Filter/Storage Systems | VWR | 28199-788 | |
| 6-well C-Dish Cover (electrical-stimulation-plate-cover) | Ion Optix | CLD6WFC | |
| 6-well plates | Fisher | 08-772-1B | |
| Agarose | Bioline USA | BIO-41025 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo | 15-240-062 | |
| C-Pace EM (cell-culture-electrical-stimulator) | Ion Optix | CEP100 | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Fisher | C79-500 | |
| Ceramic Blades for Vibrating Microtome | Campden Instruments | 7550-1-C | |
| Cooley Chest Retractor | Millennium Surgical | 63-G5623 | |
| D-Glucose | Fisher | D16-1 | |
| Disposable Scalpel #20 | Biologyproducts.com | DS20X | |
| Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning | VWR | 21008-952 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo | A3160502 | |
| Graefe Forceps | Fisher | NC9475675 | |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Histoacryl BLUE Tissue glue | Amazon | https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/ | |
| Iris Spring scissors | Fisher | NC9019530 | |
| Iris Straight Scissors | Fisher | 731210 | |
| Isoflurane, USP | Piramal | NDC 66794-017-25 | |
| ITS Liquid Media Supplement | Sigma-Aldrich | I3146-5ML | |
| Ketamine HCl (500 mg/10 mL) | West-Ward | NDC 0143-9508 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Fisher | M33-500 | |
| Mayo SuperCut Surgical Scissors | AROSurgical Instruments Corporation | AROSuperCut™ 07.164.17 | |
| Medium 199, Earle's Salts | Thermo | 11-150-059 | |
| Oxygen regulator | Praxair | ||
| Oxygen tanks – | Praxair | ||
| Plastic Pasteur pipettes | Fisher | 13-711-48 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher | AC193780010 | |
| Printer Timing Belt | Amazon | https://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/ | |
| Razor rectangle blades | Fisher | 12-640 | |
| Recombinant Human FGF basic | R&D Systems | 233-FB-025/CF | |
| Recombinant Human VEGF | R&D Systems | 293-VE-010/CF | |
| Retractable scalpels | Fisher | 22-079-716 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher | AC217125000 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | AC327300010 | |
| Vibrating Microtome | Campden Instruments | 7000 SMZ-2 | |
| Xylazine HCl (100 mg/mL) | Heartland Veterinary Supply | NADA 139-236 |
References
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