Cortar y cultuar corazones de cerdo bajo condiciones fisiológicas
Summary
Este protocolo describe cómo cortar y cultivar el tejido cardíaco en condiciones fisiológicas durante 6 días. Este sistema de cultivo podría utilizarse como plataforma para probar la eficacia de nuevas terapias de insuficiencia cardíaca, así como pruebas fiables de cardiotoxicidad aguda en un modelo de corazón 3D.
Abstract
Muchos fármacos novedosos fallan en los estudios clínicos debido a los efectos secundarios cardiotóxicos, ya que los ensayos in vitro actualmente disponibles y los modelos animales in vivo predicen mal las responsabilidades cardíacas humanas, lo que representa una carga multimillonaria para la industria farmacéutica. Por lo tanto, existe una necesidad médica mundial insatisfecha de mejores enfoques para identificar la cardiotoxicidad de los medicamentos antes de emprender costosos y lentos ensayos “primero en el hombre”. Actualmente, sólo se utilizan células cardíacas inmaduras (cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por el hombre [hiPSC-CP]) para probar la eficiencia terapéutica y la toxicidad farmacológica, ya que son las únicas células cardíacas humanas que se pueden cultivar durante períodos prolongados para probar la eficacia y toxicidad de los medicamentos. Sin embargo, un solo tipo de célula no puede replicar el fenotipo del tejido cardíaco 3D complejo que se forma de varios tipos de células. Es importante destacar que el efecto de los medicamentos debe probarse en los cardiomiocitos adultos, que tienen diferentes características y respuestas de toxicidad en comparación con los hiPSC-CP inmaduros. La cultuación de las rodajas de corazón humano es un modelo prometedor de miocardio humano intacto. Esta tecnología proporciona acceso a un sistema multicelular completo que imita el tejido cardíaco humano y refleja las condiciones fisiológicas o patológicas del miocardio humano. Recientemente, a través de la optimización de los componentes de los medios de cultivo y las condiciones de cultivo para incluir la estimulación eléctrica continua a 1,2 Hz y la oxigenación intermitente del medio de cultivo, desarrollamos una nueva configuración del sistema de cultivo que preserva la viabilidad y la funcionalidad de las rebanadas de corazón humano y de cerdo durante 6 días en cultivo. En el protocolo actual, estamos detallando el método para cortar y cultivar el corazón del cerdo como ejemplo. El mismo protocolo se utiliza para cultivar rebanadas de corazones humanos, de perros, ovejas o gatos. Este sistema de cultivo tiene el potencial de convertirse en un potente modelo predictivo humano in situ para pruebas de cardiotoxicidad aguda que cierra la brecha entre los resultados de las pruebas preclínicas y clínicas.
Introduction
La cardiotoxicidad inducida por fármacos es una de las principales causas de retirada del mercado1. En la última década delsiglo XX, ocho fármacos no cardiovasculares fueron retirados del mercado, ya que resultaron en la muerte súbita debido a arritmias ventriculares2. Además, varias terapias contra el cáncer (aunque en muchos casos eficaces) pueden conducir a varios efectos cardiotóxicos incluyendo cardiomiopatía y arritmias. Por ejemplo, las terapias tradicionales (por ejemplo, antraciclinas y radiación) como las dirigidas (por ejemplo, trastuzumab) pueden dar lugar a complicaciones cardiovasculares en un subconjunto de pacientes3. Una estrecha colaboración entre cardiólogos y oncólogos (a través del campo emergente de la “cardiooncología”) ha ayudado a que estas complicaciones sean manejables asegurando que los pacientes puedan ser tratados eficazmente2. Menos claros son los efectos cardiovasculares de los agentes más nuevos, incluyendo los inhibidores Her2 y PI3K, especialmente cuando las terapias se utilizan en combinación. Por lo tanto, existe una creciente necesidad de estrategias de detección preclínica según la vida para las toxicidades cardiovasculares asociadas con las terapias emergentes contra el cáncer antes de los ensayos clínicos en humanos. La falta de disponibilidad de sistemas de cultivo para el tejido cardíaco humano que es funcional y estructuralmente viable para más de 24 h es un factor limitante para las pruebas de cardiotoxicidad confiables. Por lo tanto, hay una necesidad urgente de desarrollar un sistema confiable para el cultivo del tejido cardíaco humano en condiciones fisiológicas para probar la toxicidad de los medicamentos.
El reciente avance hacia el uso de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por el hombre (hiPSC-CP) en las pruebas de cardiotoxicidad ha proporcionado una solución parcial para abordar este problema; sin embargo, la naturaleza inmadura de los hiPSC-CP y la pérdida de integridad tisular en comparación con la naturaleza multicelular del tejido cardíaco son las principales limitaciones de esta tecnología4. Un estudio reciente ha superado parcialmente esta limitación a través de la fabricación de tejidos cardíacos a partir de hiPSC-CM en hidrogeles y sometiéndolos a un aumento gradual de la estimulación eléctrica en el tiempo5. Sin embargo, sus propiedades electromecánicas no alcanzaron la madurez vista en el miocardio humano adulto. Por otra parte, el tejido cardíaco es estructuralmente más complicado, siendo compuesto de varios tipos de células incluyendo células endoteliales, neuronas y varios tipos de fibroblastos estromales unidos junto con una mezcla muy específica de proteínas de matriz extracelular6. Esta heterogeneidad de la población celular no cardiomiocito7,8,9 en el corazón adulto de mamífero es un obstáculo importante en el modelado de tejido cardíaco utilizando tipos de células individuales. Estas principales limitaciones ponen de relieve la importancia de desarrollar métodos para permitir el cultivo del tejido cardíaco intacto para estudios óptimos que impliquen condiciones fisiológicas y patológicas del corazón5.
Culturing human heart slices es un modelo prometedor de miocardio humano intacto. Esta tecnología proporciona acceso a un sistema multicelular 3D completo que es similar al tejido cardíaco humano que podría reflejar de manera confiable las condiciones fisiológicas o patológicas del miocardio humano. Sin embargo, su uso se ha visto severamente limitado por el corto período de viabilidad en el cultivo, que no se extiende más allá de las 24 h utilizando los protocolos más robustos reportados hasta 201810,11,12. Esta limitación se debió a múltiples factores, incluyendo el uso de la interfaz aire-líquido para cultivar las rodajas, y el uso de un medio de cultivo simple que no soporta las altas demandas energéticas del tejido cardíaco. Recientemente hemos desarrollado un sistema de cultivo sumergido que es capaz de proporcionar estimulación eléctrica continua y optimizado los componentes de los medios de cultivo para mantener las rebanadas de tejido cardíaco viables hasta 6 días13. Este sistema de cultivo tiene el potencial de convertirse en un potente modelo predictivo humano in situ para pruebas de cardiotoxicidad aguda para cerrar la brecha entre los resultados de las pruebas preclínicas y clínicas. En el artículo actual, estamos detallando el protocolo para cortar y cultivar las rodajas del corazón usando un corazón de cerdo como ejemplo. El mismo proceso se aplica a los corazones humanos, perros, ovinos o gatos. Con este protocolo, esperamos difundir la tecnología a otros laboratorios de la comunidad científica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí describimos el protocolo de vídeo detallado para nuestro método publicado recientemente para el método de rendimiento medio simplificado (procesos de hasta 48 rebanadas/dispositivo) que permite el cultivo de rodajas de corazón de cerdo durante un período lo suficientemente largo como para probar la cardiotoxicidad aguda13. Las condiciones propuestas imitan el entorno del corazón, incluyendo la frecuencia de estimulación eléctrica, la disponibilidad de nutrientes y la oxigenación int…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
TMAM es apoyado por la concesión DE NIH P30GM127607 y la concesión 16SDG29950012 de la American Heart Association. RB es compatible con P01HL78825 y UM1HL113530.
Materials
| 1000ml, 0.22µm, Vacuum Filter/Storage Systems | VWR | 28199-812 | |
| 2,3-Butanedione monoxime (BDM) | Fisher | AC150375000 | |
| 500ml, 0.22µm, Vacuum Filter/Storage Systems | VWR | 28199-788 | |
| 6-well C-Dish Cover (electrical-stimulation-plate-cover) | Ion Optix | CLD6WFC | |
| 6-well plates | Fisher | 08-772-1B | |
| Agarose | Bioline USA | BIO-41025 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo | 15-240-062 | |
| C-Pace EM (cell-culture-electrical-stimulator) | Ion Optix | CEP100 | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Fisher | C79-500 | |
| Ceramic Blades for Vibrating Microtome | Campden Instruments | 7550-1-C | |
| Cooley Chest Retractor | Millennium Surgical | 63-G5623 | |
| D-Glucose | Fisher | D16-1 | |
| Disposable Scalpel #20 | Biologyproducts.com | DS20X | |
| Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning | VWR | 21008-952 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo | A3160502 | |
| Graefe Forceps | Fisher | NC9475675 | |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Histoacryl BLUE Tissue glue | Amazon | https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/ | |
| Iris Spring scissors | Fisher | NC9019530 | |
| Iris Straight Scissors | Fisher | 731210 | |
| Isoflurane, USP | Piramal | NDC 66794-017-25 | |
| ITS Liquid Media Supplement | Sigma-Aldrich | I3146-5ML | |
| Ketamine HCl (500 mg/10 mL) | West-Ward | NDC 0143-9508 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Fisher | M33-500 | |
| Mayo SuperCut Surgical Scissors | AROSurgical Instruments Corporation | AROSuperCut™ 07.164.17 | |
| Medium 199, Earle's Salts | Thermo | 11-150-059 | |
| Oxygen regulator | Praxair | ||
| Oxygen tanks – | Praxair | ||
| Plastic Pasteur pipettes | Fisher | 13-711-48 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher | AC193780010 | |
| Printer Timing Belt | Amazon | https://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/ | |
| Razor rectangle blades | Fisher | 12-640 | |
| Recombinant Human FGF basic | R&D Systems | 233-FB-025/CF | |
| Recombinant Human VEGF | R&D Systems | 293-VE-010/CF | |
| Retractable scalpels | Fisher | 22-079-716 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher | AC217125000 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | AC327300010 | |
| Vibrating Microtome | Campden Instruments | 7000 SMZ-2 | |
| Xylazine HCl (100 mg/mL) | Heartland Veterinary Supply | NADA 139-236 |
References
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